Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

우리는 금융 지원을 해 서울에 게 수 여 하는 NIH 보조금 (RO1AI118992) 감사 합니다. 우리는 기술 지원에 대 한 웨인 주립 대학에서 현미경, 이미징 & Cytometry 리소스 (MICR) 핵심 시설을 감사합니다.

1. 셀 시드 및 바이러스 감염
<ol><li>바이러스 감염 하기 전에 20-24 h, 5 x 104 인간 배아 폐 (헬) 섬유 아 세포 세포 또는 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 소 보충 4 잘 11 m m 정열된 슬라이드에 검사할 수 다른 셀의 씨앗 혈 청 (FBS))입니다. 5% 이산화탄소 (CO2) 37 ° C에 세포를 품 어. 참고: 각 잘 있어야 한다 70-80% 셀 confluency 감염의 시간에서.</li>
	<li>다음 날, 성장 매체?...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

이 프로토콜은 HSV-1 ICP0의 핵-세포질 전 공부에 사용 되었습니다. ICP0는 HSV-1 감염 (그림 1) 동안 subcellular 밀매를 겪 습. 아마, ICP0 다른 위치에서 다른 기능을 수행 하기 위해 다양 한 셀 통로와 상호 작용 합니다. 미세 조정 인간의 호스트13투쟁에서의 여러 기능을 ICP0 수 있습니다. 그러나, ICP0 공간 일시적인 방식 다중 기능을 조정 하는 방법 안 되어 잘 공부 ?...

포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1) 다양 한 포진 labialis, 생식 기 포진, 각 막 실질 염, 뇌염 등 심각한 herpetic 질병에 약한 원인. 일단 감염, 바이러스는 중추 신경에 평생 잠복 감염을 설정 합니다. 때때로, 바이러스 열 병, 스트레스, 면역 억제1, 재발 성 헤 르 페 스 감염에 지도 등 다양 한 이유로 다시 활성화 될 수 있습니다. 감염 된 세포 단백질 0 (ICP0)는 주요 바이러스 레 귤 레이 터 모두 용균성 및 잠재 HSV-1 감염에 대 한 중요 한 이다. 그것은 다운스트림 바이러스 유전자를 통해 counteracting 호스트 내장/타고 난 항 바이러스 방어2,3transactivates. ICP0는 E3 유비퀴틴 리가 활동을, 프로테아좀 종속 저하3에 대 한 몇 가지 셀 요소를 대상으로 하고있다. 그것은 또한 그들의 활동을 규제 하 고 이후에 호스트 항 바이러스 제한3오프셋 다양 한 셀 통로와 상호 작용 합니다. ICP0는 감염 진행3,,45다른 subcellular 구획에서 찾을 알려져 있다. 단백질은 잔류물 500 5066에 위치한 리/아르기닌 풍부한 핵 지 방화 신호 (NLS) 있다. 초기 HSV-1 감염에 드 노 보 합성 시 ICP0 핵으로 즉시 가져옵니다. 처음 감지 동적 핵에 구조 나 핵 도메인 10 (ND10)7. 유비퀴틴 E3 리가 활동 ICP0 ND10 주최자 단백질, promyelocytic 백혈병 (PML) 단백질 및 단백질 얼룩 덜 룩 한 100 kDa (Sp100)8,,910의 저하를 트리거합니다. 주최자 단백질의 손실 후에 ND10 핵 시체는 분산 하 고 ICP0 전체 핵4,11을 채우기 위해 확산.
흥미롭게도, 바이러스 성 DNA 복제의 개시 후 ICP0는 핵에서 사라집니다. 그것은 전적으로 HSV-1 감염4,12에 핵-세포질 전 좌의 발생을 제안 하는 세포질에서 발견 된다. DNA 복제의 요구는 HSV-1 ICP04,12의 세포질 전 촉진에 늦게 바이러스 성 protein(s)의 잠재적인 참여를 의미 합니다. 분명히 공간 일시적인 패션에 다양 한 세포질 통로에 그것의 상호 작용을 조절 하는 ICP0 힘을 실어주 고 ICP0 감염 시 다른 구획 사이에서 매매 하 고 따라서 좌표 벌금의 여러 기능 사이의 균형 조정 용균성 및 잠재 HSV-1 감염13. 더 나은 이해 ICP0 많은 용균성 감염에 걸쳐 ICP0 기능 도메인의 조정, 하 우리는 신중 하 게 동적 ICP0 전12의 분자 기초 해 부. 기계 연구 이전에 보고 된12를 실시, 우리 confocal 현미경 다른 감염 상태에서 ICP0 subcellular 지 방화를 시각화 하는 immunofluorescent 착 방법을 적용 했습니다. 우리는 또한 핵 및 세포질 배급 ICP0의 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하는 양적 프로토콜을 개발 했습니다. HSV-1에 감염 된 세포의 인구는 감염 단계에 걸쳐 표로 하 고 다른 생 화 확 적인 치료12에서 ICP0 운동의 동향을 분석 했다. 여기 우리는 상세한 프로토콜 감염 HSV-1에에서는 문서 ICP0 전 좌를 설명합니다. 이 메서드는 핵 및 세포질 전 라이브 이미징 기법으로 인해 적용 되지 않습니다 때 라이브 이미징 하는 대신 봉사 할 수 있는 다른 바이러스 또는 세포질 단백질에 대 한 공부를 하는 일반적인 방법으로 채택 될 수 있는 제안 방법, 신호 강도, 또는 단백질 풍부 라벨 같은 문제.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1)의 감염 된 세포 단백질 0 (ICP0) 링 타입 E3 유비퀴틴 리가 포함 하는 즉시 초기 단백질이입니다. 그것은 호스트 제한 요인 및 후속 바이러스 유전자 활성화 proteasomal 저하에 대 한 책임입니다. ICP0 정식 핵 지 방화 순서를 (NLS)에 포함 되어 있습니다. 그것은 합성 드 노 보 직후 핵을 입력 하 고 핵에 주로 그 반대로 호스트 방어 기능을 실행. 그러나, 나중에 감염, ICP0에서에서 발견 된다 전적으로 세포질, 핵-세포질 전 HSV-1 감염 시의 발생을 제안. 아마도 ICP0 전 다른 감염 단계에서의 subcellular 위치 그것의 기능을 조절 하는 ICP0 수 있습니다. 생물 학적 기능 및 규제 메커니즘 ICP0 핵-세포질 전 좌의 윤곽을 그리 다, 위해 우리는 HSV-1 감염 시 ICP0 매매 모니터링 하는 immunofluorescent 현미경 검사 법 방법 수정. 이 프로토콜 immunofluorescent 얼룩, confocal 현미경 이미징, 그리고 핵 및 세포질 배급 분석을 포함 한다. 이 프로토콜의 목표는 정상 상태 confocal 이미지가 용균성 감염에 걸쳐 ICP0 운동의 양적 문서로 시간 코스에 적응. 우리가 제안 하는이 방법은 양적 라이브 이미징 기술을 사용 하지 않고도 다른 바이러스 또는 세포질 단백질의 핵 및 세포질 지역화 분석에 일반화 될 수 있다.

분자 및 ICP0 HSV-1 감염 시 밀매의 생물 학적 기능을 이해 하기 우리는 다른 감염 단계에서 ICP0 subcellular 분포를 분석 하는 immunofluorescent 현미경 메서드를 사용 합니다. 그림 1 에서는 감염 진행으로 독특한 ICP0 지역화와 함께 대표적인 셀. ICP0의 핵-세포질 전 계량, 감염 된 세포를 세 그룹으로 분류 하 여 핵 상대적인 ICP0 분포 분석: 핵 지역화, 세포질 지?...

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Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

ICP0는 HSV-1 감염 중 핵-세포질 전을 겪 습. 이 이벤트의 분자 메커니즘은 알 수 없습니다. 여기는 HSV-1 감염, 양적 분석 ICP0 전 미래 기계 론 적인 연구에 대 한 기초를 낳는 ICP0 운동 척도를 도구로 confocal 현미경의 사용에 설명 합니다.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

이 방법은 빛 화상 진찰을 사용할 수 없는 시스템에서 핵과 세포질 전좌에 관하여 단백질 인신 매매 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광 화상 진찰을 포함하지 않고 측두단백질 운동의 연구를 위한 일반적인 프로토콜로 적용될 수 있다는 것입니다. 바이러스 감염 전 20~24시간 전에 5배 10번~ 4개의 인간 배아 폐 또는 HEL 섬유 폭발 세포가 잘 4개의 우물에 11mm 비틀거리고 성장 배지가 37°C에서 이산화탄소를 5%로 하였다.배양 배지가 유출되는 것을 피하면서 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 슬라이드를 철저히 흔들어야 합니다. 다음 날, 슈퍼네이츠를 교체하여 70~80%의 수렴 문화를 199로, 셀당 410개의 플라크 형성 유닛을 포함하고, 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들어 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 수퍼네티를 신선한 성장 배지로 대체하고 적절한 실험 감염 기간 동안 인큐베이터로 세포를 반환한다.바이러스에 감염된 세포의 면역 형광 염색의 경우 PBS로 세포를 세 번 빠르게 씻으실 수 있습니다. 그 다음으로 PBS에서 4%의 파라포름알데히드의 200마이크로리터에서 8분에서 10분 배양이 이어졌습니다. 고정의 끝에서, 세척 당 PBS의 200 마이크로 리터로 세포를 세 번 세척하고, 5 ~ 10 분 동안 잘 100 마이크로 리터의 0.2 %의 비 이온 계면 활성제로 세포를 퍼메아빌화.입증된 대로 PBS에서 투과된 세포를 세 번 세척하고 실온에서 1시간 배양을 위해 각 웰에 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 2시간 실온 인큐베이션을 위해 각 웰에 관심 있는 1차 항체의 적절한 농도를 추가한다. 인큐베이션의 끝에서, 신선한 차단 버퍼에 3, 10 분 세척과 모든 언바운드 기본 항체를 제거하고, 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 배양에 대한 각 우물에 적절한 이차 항체를 추가합니다.인큐베이션이 끝나면, 입증된 대로 블로킹 버퍼에서 세포를 세 번 씻고, PBS에서 한 번 세척한 다음, DAPI로 보충된 안티페이드 장착 배지 1방울을 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 슬라이드 위에 덮개 슬립을 놓고 투명한 매니큐어로 커버 슬로프를 밀봉합니다. 커버 슬립을 장착하는 동안 부드러운 압력을 가하면 과도한 장착 매체가 제거되어 고품질 이미지를 획득하는 데 도움이 됩니다.표지된 감염된 세포의 공초점 이미징의 경우 적절한 이차 항체 및 DAPI 파장을 선택하고 이미지 포맷을 평균 8개의 라인으로 1, 024 x 1, 024 픽셀로 설정합니다. 그런 다음 100x 목표 아래 4웰 슬라이드에서 각 우물을 이미지합니다. 셀의 큰 숫자를 계산하기 위해, 40배 목표 하에서 동일한 웰의 연속 필드에서 5~10개의 이미지를 얻을 수 있습니다.ICP0의 핵 및 세포질 분포를 분석하려면 공초점 응용 소프트웨어에서 프로젝트를 열고 이미지를 선택합니다. 수량 탭을 열고 도구 메뉴에서 관심 영역 정렬을 선택합니다. 그리기 선을 선택하고 분석할 셀 전체에 세로선을 그립니다.히스토그램은 관심 있는 단백질과 DAPI 모두에 대한 선을 따라 형광 강도를 나타내는 것으로 나타납니다. 배경 염색에 기초하여, 각 실험에서 단백질의 세포 분포의 분석을 위해 관심 있는 단백질의 강도에 대한 일정한 임계값을 설정한다. 단백질 신호가 평균적으로 핵 영역에서 임계값 미만이지만 DAPI 경계를 넘어 임계값을 초과하는 경우 단백질 신호를 주로 세포질 내에 있는 것으로 분류한다.단백질 신호가 핵 전체의 임계값 을 초과하고 DAPI 신호의 경계를 넘어서면 단백질 신호를 핵 플러스 세포질 국소화로 그룹화한다. 단백질 신호가 핵의 임계값 이상인 경우, 평균적으로 DAPI 신호군의 경계 외부임계값 이하인 경우 단백질 신호는 핵 국소화로서 이다. 마지막으로, 각 샘플에서 200개 이상의 감염된 세포를 상이한 감염 시점에서 표로 꾸미고, 시간이 지남에 따라 관심 있는 단백질의 움직임을 설명하기 위해 바 그래프로 데이터를 플롯한다.입증 된 바와 같이,이 방법은 관심있는 단백질의 핵 세포질 전좌의 분석을 용이하게한다. 예를 들어, 감염된 세포 단백질 제로, 또는 ICP0 세포 세포 분포는 바이러스 감염이 진행됨에 따라 변화한다. 감염 시 ICP0 인신매매에 필요한 요소를 이해하기 위해 ICP0 운동은 다른 감염 단계에서 야생 유형 및 돌연변이 유형 헤르페스 심플렉스 바이러스 1-감염된 세포에서 추적될 수 있으며, 감염의 다른 시간 지점에서 ICP0의 하위 세포 분포의 평가를 허용합니다.바이러스가 세포에 동등한 접근을 가지고 있고 감염 진행이 바이러스 사이 및 내의 비교되도록 바이러스 제목에 따라 감염의 복합성을 정상화하기 위하여 단층 배양을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 발달 후에, 이 기술은 세포 인구 내의 관심 있는 단백질의 시간적 세포 소소화를 공부하여 단백질 운동을 탐구하는 생물학과 세포 바이러스학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...