Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi takker økonomisk støtte fra en NIH stipend (RO1AI118992) til Haidong Gu. Vi takker mikroskopi, tenkelig & cytometri ressurser (MICR) Core anlegget ved Wayne State University for kundestøtte.

1. celle såing og virusinfeksjon
<ol><li>På 20-24 h før virusinfeksjon, frø 5 x 104 av menneskelige embryonale lunge (HEL) fibroblast celler eller andre celler bli undersøkt på et 4-brønn 11 mm forskjøvet lysbilde i vekst medium (Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets storfe serum (FBS)). Inkuber cellene på 37 ° C med 5% karbondioksid (CO2). Merk: Hver vel bør har 70-80% celle confluency på tidspunktet for infeksjon.</li>
	<li>På den neste dagen, Fjern vekstmediet o...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

Denne protokollen er brukt til å studere kjernefysiske-til-cytoplasmatiske translokasjon av HSV-1 ICP0. ICP0 gjennomgår subcellular smugling under HSV-1-infeksjon (figur 1). Sannsynlig samhandler ICP0 med ulike celle veier å utføre ulike funksjoner på forskjellige steder. Dette kan ICP0 å finjustere dets funksjoner i tug-of-war med menneske vert13. Men er hvor ICP0 koordinerer flere funksjoner i en romlig-temporalt måte ikke godt studert. Med fluorescerende mik...

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) fører en rekke av mild til alvorlig postherpetisk sykdommer som herpes labialis, genital herpes, stromal keratitt og encefalitt. En gang infisert, oppretter viruset en livslang latente infeksjon i Ganglion neurons. Noen ganger kan viruset reaktiveres av forskjellige grunner som feber, stress og uimottakelig undertrykkelse1, fører til tilbakevendende herpes infeksjon. Infiserte cellen protein 0 (ICP0) er en viktig viral regulator avgjørende for både lytisk og latente HSV-1-infeksjon. Det transactivates nedstrøms virus gener via motvirke vert iboende/medfødte antiviral forsvar2,3. ICP0 har en E3 ubiquitin ligase aktivitet, som mål celle faktorer for proteasome-avhengige fornedrelse3. Det også samhandler med ulike celle stier å regulere sine aktiviteter og senere å kompensere vert antiviral restriksjoner3. ICP0 er kjent for å finne på ulike subcellular avdelinger som infeksjonen går3,4,5. Protein har lysin/arginine-rik kjernefysiske lokalisering signal (NLS) på rester 500 til 5066. På de novo syntese på tidlig HSV-1-infeksjon importeres ICP0 umiddelbart til kjernen. Det er først oppdaget på en dynamisk kjernefysiske struktur kalt kjernefysiske domene 10 (ND10)7. E3 ubiquitin ligase aktiviteten til ICP0 utløser nedbrytning av ND10 organizer proteiner, promyelocytic leukemi (PML) protein og flekkete protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Etter tapet av arrangøren proteiner, ND10 kjernefysiske organer er spredt og ICP0 er diffust for å fylle hele kjernen4,11.
Interessant, etter utbruddet av viral DNA-replikasjon forsvinner ICP0 fra kjernen. Den finnes kun i cytoplasma, tyder forekomsten av en kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon sent i HSV-1-infeksjon4,12. Kravet til DNA-replikasjon innebærer mulige involvering av en sen viral protein(s) å tilrettelegge cytoplasmatiske translokasjon av HSV-1 ICP04,12. Tydeligvis ICP0 handel blant forskjellige rom under infeksjon gir ICP0 til å modulere sin interaksjoner ulike mobilnettet stier i en romlig-temporalt mote, og derfor koordinere dets funksjoner til å justere balansen mellom lytisk og latente HSV-1-infeksjon13. For bedre å forstå ICP0 multifunksjonalitet og samordning av ICP0 funksjonelle domener gjennom lytisk infeksjonen, dissekert vi nøye molekylær grunnlag av dynamisk ICP0 translokasjon12. For å gjennomføre den mekanistiske studier tidligere rapportert12, har vi brukt en immunofluorescent flekker metode for å visualisere ICP0 subcellular lokalisering på ulike infeksjonsstatus under AC confocal mikroskop. Vi har også utviklet en kvantitativ protokoll for å analysere kjernefysiske vs cytoplasmatiske distribusjon av ICP0 ved hjelp av AC confocal programvare. Befolkningen av HSV-1-infiserte celler ble ordnet i infeksjon fasene og utviklingen av ICP0 bevegelse ble analysert, under forskjellige biokjemiske behandlinger12. Her beskriver vi detaljerte protokollen at dokumenter ICP0 translokasjon i HSV-1-infeksjon. Vi foreslår at denne metoden kan bli vedtatt som en generell metode å studere kjernefysiske vs cytoplasmatiske translokasjon for andre virus eller cellular proteiner, som kan tjene som et alternativ til live imaging når live bildebehandling teknikken er uanvendelig grunn problemer som merking metoden, signalet intensitet eller protein overflod.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

Infiserte cellen protein 0 (ICP0) av herpes simplex virus 1 (HSV-1) er en umiddelbar tidlig protein inneholder en RING-type E3 ubiquitin ligase. Det er ansvarlig for proteasomal nedbrytning av vert faktorer for restriktiv og påfølgende viral genet aktivering. ICP0 inneholder en kanoniske kjernefysiske lokalisering sekvens (NLS). Det går inn i kjernen umiddelbart etter de novo syntese og utfører sine anti-vert forsvar funksjoner i kjernen. Men senere i infeksjon, er ICP0 funnet utelukkende i cytoplasma, tyder forekomsten av en kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon under HSV-1-infeksjon. Antagelig kan ICP0 translokasjon ICP0 til å modulere funksjonene i henhold til subcellular steder i ulike infeksjon faser. For å avgrense den biologiske funksjonen og regulatoriske mekanisme ICP0 kjernefysiske-til-cytoplasmatiske translokasjon, endret vi en immunofluorescent mikroskopi metode for å overvåke ICP0 smugling under HSV-1-infeksjon. Denne protokollen innebærer immunofluorescent flekker, AC confocal mikroskop tenkelig og kjernefysiske vs cytoplasmatiske distribusjon analyse. Målet med denne protokollen er å tilpasse steady state AC confocal bilder tatt i en tid kurs i en kvantitativ dokumentasjon ICP0 bevegelse gjennom lytisk infeksjonen. Vi foreslår at denne metoden kan generaliseres kvantitativt analysere kjernefysiske vs cytoplasmatiske lokalisering av andre virus eller cellular proteiner uten å involvere live bildeteknologi.

For å forstå molekylær grunnlag og biologiske funksjoner for ICP0 menneskehandel under HSV-1-infeksjon, bruker vi en immunofluorescent mikroskopi metoden for å analysere ICP0 subcellular distribusjon i forskjellige infeksjon faser. Figur 1 viser representant cellene med særegne ICP0 lokalisering som infeksjonen utvikler seg. For å kvantifisere kjernefysiske-til-cytoplasmatiske translokasjon av ICP0, vi analyserer ICP0 distribusjon i forhold til kjernen ...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Timelige analyse av kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon av et Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescent AC Confocal mikroskopi

ICP0 gjennomgår kjernefysiske-til-cytoplasmatiske translokasjon under HSV-1-infeksjon. Molekylær mekanismen av denne hendelsen er ikke kjent. Her beskriver vi bruk av AC confocal mikroskop som et verktøy for å kvantifisere ICP0 bevegelse i HSV-1-infeksjon, som legger grunnlaget for kvantitativt analysere ICP0 translokasjon i fremtidige mekanistisk studier.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i proteinhandelfeltet om kjernefysisk og cytoplasmatisk translokasjon i systemet der lett avbildning ikke er tilgjengelig. Den største fordelen med denne teknikken er at den kan brukes som en generell protokoll for studiet av temporal proteinbevegelse uten å involvere lysavbildning. 20 til 24 timer før virusinfeksjonsfrøet 5 ganger 10 til de 4 humane embryonale lunge- eller HEL-fibereksplosjonscellene per brønn på en fire brønn 11 millimeter forskjøvet lysbilde og vekstmedium for overnattingsinkubasjon ved 37 grader Celsius med fem prosent karbondioksid.Det er viktig å rocke lysbildet grundig for å sikre en jevn fordeling av cellene mens du tar vare på å unngå å søle kulturmediet. Neste dag erstatter du supernativane slik at de 70 til 80 prosent samløpete kulturene med Medium 199, som inneholder 410 plakettdannende enheter per celle, og plasserer lysbildet på 37 grader Celsius med risting, i en time. På slutten av inkubasjonen erstatter du supernativa med frisk vekstmedium og returnerer cellene til inkubatoren for riktig eksperimentell infeksjonsperiode.For immunofluorescerende farging av virus-infiserte celler, vask raskt cellene tre ganger med PBS. Etterfulgt av en åtte til ti minutters inkubasjon i 200 mikroliter på fire prosent paraformaldehyd i PBS per brønn. På slutten av fikseringen vasker cellene tre ganger med 200 mikroliter PBS per vask, og gjennomsyrer cellene med 100 mikroliter på 0,2 prosent ikke-ionisk overflateaktivt middel per brønn i fem til ti minutter.Vask de permeabiliserte cellene tre ganger i PBS som demonstrert, og tilsett 200 mikroliter blokkerer buffer til hver brønn i en times inkubasjon ved romtemperatur. Deretter legger du til riktig konsentrasjon av det primære antistoffet av interesse for hver brønn for en to timers romtemperaturinkubasjon. På slutten av inkubasjonen fjerner du et ubundet primært antistoff med tre, ti minutters vasker i fersk blokkeringsbuffer, og legger til et passende sekundært antistoff til hver brønn i en times inkubasjon ved romtemperatur, beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen, vask cellene tre ganger i en blokkeringsbuffer som demonstrert, etterfulgt av en vask i PBS og legg til en dråpe antifademonteringsmedium supplert med DAPI til hver brønn. Plasser deretter et deksel slip over lysbildet og forsegle dekselet skråningen med gjennomsiktig neglelakk. Ved hjelp av skånsomt trykk mens du monterer dekkseddelen, fjernes overflødig monteringsmedium, noe som bidrar til å sikre oppkjøpet av bilder av høy kvalitet.For konfokal avbildning av de merkede, infiserte cellene, velg riktig sekundært antistoff og DAPI bølgelengder, og sett bildeformatet til 1, 024 x 1 024 piksler med en gjennomsnittlig linje på åtte. Deretter bilde hver brønn på fire-brønns lysbilde under 100x målet. For å telle et stort antall celler, få fem til ti bilder fra påfølgende felt i samme brønn under 40x målet.For å analysere kjernefysisk og cytoplasmatisk distribusjon av ICP0, åpne prosjektet i den kondokkale applikasjonsprogramvaren og velg et bilde. Åpne kategorien Antall, og velg Sorter interesseområder på Verktøy-menyen. Velg Tegn linje, og tegn en langsgående linje over cellen som skal analyseres.Et histogrammet vil vises som viser fluorescensintensiteten langs linjen for både protein av interesse, og DAPI. Basert på bakgrunnsfargingen, sett opp en konstant terskel for intensiteten av proteinet av interesse for analyse av den subcellulære fordelingen av proteinet i hvert eksperiment. Hvis proteinsignalet i gjennomsnitt er under terskelen i atomregionen, men er over terskelen utenfor DAPI-grensen, kategoriserer proteinsignalet som hovedsakelig plassert i cytoplasma.Hvis proteinsignalet er over terskelen gjennom kjernen, og utenfor grensen til DAPI-signalet, grupper proteinsignalet som en kjerne pluss cytoplasmatisk lokalisering. Hvis proteinsignalet er over terskelen i kjernen, men i gjennomsnitt er under terskelen utenfor grensen til DAPI-signalgruppen proteinsignalet som en kjernefysisk lokalisering. Til slutt, tabulate mer enn 200 infiserte celler fra hver prøve på ulike infeksjontidspunkter, og plott dataene i en stolpegraf for å illustrere bevegelsen av protein av interesse over tid.Som demonstrert, letter denne metoden analysen av kjernefysisk-til-cytoplasmatisk translokasjon av proteiner av interesse. For eksempel endres infisert celleprotein null, eller ICP0 subcellulær distribusjon endres etter hvert som en virusinfeksjon utvikler seg. For å forstå elementene som kreves for ICP0-smugling under infeksjon, kan ICP0-bevegelser spores i Wild Type og Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-infiserte celler i ulike infeksjonsfaser, slik at evalueringen av den subcellulære fordelingen av ICP0 på forskjellige infeksjonspunkter.Det er viktig å huske å bruke monolayer kulturer slik at virions har lik tilgang til cellene og å normalisere mangfoldet av infeksjon i henhold til virustittelen slik at infeksjonsprogresjon er sammenlignbar mellom og innenfor virus. Etter hver utvikling banet denne teknikken vei for forskere innen biologi og celle virologi for å utforske proteinbevegelse ved å studere de timelige subcellulære lokaliseringer av proteiner av interesse i en cellepopulasjon.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av Spleen: Kvantitativ analyse av Parasite Mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Påvisning av giftstoffer translokasjon i Host cytosol ved Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolasjon og Genome Analysis of single Virioner bruker &#39;enkelt virus Genomics&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere Anti-sopp aktivitet av isolerte alveolære makrofager ved konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av musen Mx1 Protein med influensa A virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokasjon i vertsceller Bruke Beta-laktamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...