Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим финансовой поддержке гранта NIH (RO1AI118992) присуждена Хайдун ГУ. Мы благодарим микроскопии, изображений и Core цитометрии ресурсов (MICR) объекта в Уэйнском Государственном университете для технической поддержки.

1. клетки посева и вирусной инфекции
<ol><li>В 20 – 24 ч до вирусной инфекции семян 5 х 104 клетки фибробластов человека эмбриональных легких (HEL) или другие клетки быть расмотренным на 11 мм 4-ну шахматном слайд в среднего роста (Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% плода говядину сывор?...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

Этот протокол был использован для изучения ядерной и цитоплазматических транслокации HSV-1 ICP0. ICP0 проходит, субцеллюлярные людьми во время инфекции HSV-1 (рис. 1). Вероятно ICP0 взаимодействует с различных клеток пути для выполнения различных функций в разных местах. Это позво?...

Вирус простого герпеса (ВПГ-1) 1 вызывает широкий спектр легкой до тяжелой герпетические заболевания, включая labialis герпеса, генитальный герпес, стромальный кератит и энцефалит. После заражения, вирус устанавливает пожизненными латентной инфекции в ганглиях нейронов. Иногда вирус может быть возобновлена по различным причинам, такие как лихорадка, стресс и подавление иммунной1, приводит к инфекции рецидивирующий герпес. Инфицированной клетки белки 0 (ICP0) является ключевым регулятором вирусный решающее значение для литические и латентной инфекции HSV-1. Она transactivates вниз по течению вирус гены через противодействие хост внутренней/врожденной противовирусное оборону2,3. ICP0 имеет действие убиквитин лигаза E3, которая ориентирована на несколько клеток факторов для протеасом зависимой деградации3. Он также взаимодействует с различных путей клеток регулировать их деятельность и впоследствии компенсировать хост противовирусное ограничения3. Известно, что ICP0 найти на различных внутриклеточных отсеков, как инфекция переходит в3,4,5. Белок имеет лизин/аргинин богатые ядерной локализации сигнал (NLS), расположенный на остатки 500 до 5066. После de novo синтеза в ранней инфекции HSV-1 ICP0 немедленно импортируется в ядро. Обнаруживается сначала на динамический ядерные структуры называют ядерной области 10 (ND10)7. E3 убиквитин лигаза активность ICP0 вызывает деградацию ND10 Организатор белки, белка promyelocytic лейкемия (PML) и крапинами белка 100 кДа (Sp100)8,9,10. После потери Организатор белков ND10 ядерных органы рассредоточены и ICP0 распространяется для заполнения всего ядро4,11.
Интересно, что после начала вирусной репликации ДНК, ICP0 исчезает из ядра. Он находится исключительно в цитоплазме, предлагая возникновение ядерного в цитоплазматического транслокации инфекции HSV-14,12в конце. Требование о репликации ДНК подразумевает потенциального участия конце вирусные белки в содействии цитоплазматических транслокации HSV-1 ICP04,12. Видимо ICP0 торговли людьми среди различных отсеках во время инфекции дает ICP0 чтобы модулировать его взаимодействия различных клеточных путей в пространственно временных моды, и поэтому координировать его несколько функций для тонкой настройки баланса между литических и латентных HSV-1 инфекции13. Чтобы лучше понять ICP0 многофункциональности и координации ICP0 функциональные домены на протяжении литические инфекции, мы тщательно расчлененный молекулярные основы динамических транслокации ICP012. Для проведения механистический исследований сообщалось ранее12, мы применили метод immunofluorescent окрашивание визуализировать субцеллюлярные локализации ICP0 на различные инфекции статуса согласно конфокального микроскопа. Мы также разработали количественный протокол для анализа ядерных против цитоплазмы распределения ICP0 с помощью конфокальной программного обеспечения. Популяция клеток инфицированных HSV-1 был рассчитанной на этапах инфекции и были проанализированы тенденции движения ICP0, в12различных биохимических методов лечения. Здесь мы описываем подробный протокол, что документы ICP0 транслокации инфекции HSV-1. Мы предлагаем, что этот метод может быть принят в качестве общего метода для изучения транслокации цитоплазмы ядерной против других вирусных или клеточных белков, которые могут служить альтернативой живых изображений когда живой Тепловизионная техника не применяется из-за такие проблемы, как маркировка метод, интенсивности сигнала или белков изобилия.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

Инфицированная клетка белок 0 (ICP0) вируса простого герпеса (ВПГ-1) 1 является немедленное раннего белок, содержащий убиквитин лигаза КОЛЬЦЕВОГО типа E3. Это ответственность за ухудшение протеосомной пребывания ограничительных факторов и последующих вирусных генов активации. ICP0 содержит последовательность каноническое ядерной локализации (NLS). Он проникает в ядро сразу же после de novo синтеза и выполняет свои функции Анти принимающей обороны главным образом в ядре. Однако позже в инфекции, ICP0 находится исключительно в цитоплазме, предлагая возникновение ядерного в цитоплазматического транслокации во время инфекции HSV-1. Предположительно ICP0 транслокации позволяет ICP0 модулировать свои функции согласно его субцеллюлярные места на этапах различные инфекции. Для того, чтобы разграничить биологической функции и механизм регулирования ядерной и цитоплазматических ICP0 транслокации, мы изменили методом immunofluorescent микроскопии для мониторинга ICP0 людьми во время инфекции HSV-1. Этот протокол включает в себя immunofluorescent окрашивание, Конфокальный микроскоп изображений и ядерной против цитоплазмы анализ распределения. Цель настоящего Протокола заключается в адаптации устойчивого состояния конфокальный снимки, сделанные в времени курс в количественных документации ICP0 движения на протяжении всего литические инфекции. Мы предлагаем, что этот метод может быть обобщена количественно анализировать ядерной против цитоплазмы локализации других вирусных или клеточных белков без привлечения живой технологии визуализации.

Чтобы понять молекулярные основы и биологические функции ICP0 торговли людьми во время инфекции HSV-1, мы используем метод immunofluorescent микроскопии для анализа ICP0 субцеллюлярные распределения на этапах различные инфекции. Рисунок 1 показывает представитель ...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Временной анализ ядерных и цитоплазматических транслокации герпеса вирус 1 белок, Immunofluorescent конфокальная микроскопия

ICP0 подвергается ядерной и цитоплазматических транслокации во время инфекции HSV-1. Молекулярный механизм этого события не известна. Здесь мы описываем использование Конфокальный микроскоп как инструмент для количественной оценки ICP0 движения в инфекции HSV-1, которая закладывает основу для количественного анализа ICP0 транслокации в механистической будущих исследований.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области торговли белками о ядерной и цитоплазмической транслокации в системе, в рамках которой световой визуализации нет. Основным преимуществом этой техники является то, что она может быть применена в качестве общего протокола для изучения движения височного белка без привлечения световой визуализации. От 20 до 24 часов до начала вирусной инфекции семян 5 раз 10 до 4 человеческих эмбриональных легких или HEL волокна взрывных клеток на хорошо на четыре хорошо 11 миллиметров шахматном слайд и рост среды для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию с пятью процентами двуокиси углерода.Важно, чтобы рок слайд тщательно, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, заботясь, чтобы избежать разлива культуры среды. На следующий день, заменить supernatants так 70 до 80 процентов слияние культур со средним 199, содержащий 410 доска формирования единиц на клетку, и место слайд на 37 градусов по Цельсию со тряской, в течение одного часа. В конце инкубации замените супернатанты свежей средой роста и верните клетки в инкубатор для соответствующего экспериментального инфекционного периода.Для иммунофлуоресцентного окрашивания инфицированных вирусом клеток, быстро мыть клетки три раза с PBS. Затем от восьми до десяти минут инкубации в 200 микролитров четыре процента параформальдегида в PBS на колодец. В конце фиксации, мыть клетки три раза с 200 микролитров PBS на стирку, и пронизывают клетки с 100 микролитров 0,2 процента неионных сурфактант на хорошо в течение пяти-десяти минут.Вымойте проницаемые клетки три раза в PBS, как попродемонстрировано, и добавьте 200 микролитров блокирующего буфера к каждому колодец в течение одного часа инкубации при комнатной температуре. Далее добавьте соответствующую концентрацию первичного антитела, представляющих интерес для каждой хорошо для двухчасовой инкубации комнатной температуры. В конце инкубации удалите любое несвегаемое первичное антитело с тремя, десятиминутными стирками в свежем блокирующего буфере и добавьте соответствующее вторичное антитело к каждому колодец для часовой инкубации при комнатной температуре, защищенной от света.В конце инкубации, мыть клетки три раза в блокирующий буфер, как попродемонстрировано, а затем один мыть в PBS и добавить одну каплю антифада монтажа среды дополняется DAPI к каждому хорошо. Затем поместите крышку скольжения по слайду и запечатать крышку склона с прозрачным лаком для ногтей. Применение мягкого давления при монтаже крышки скольжения будет удалить любые избыточные монтаж среды, помогая обеспечить обеспечение приобретения высококачественных изображений.Для конфокального изображения помеченных, инфицированных клеток выберите соответствующие вторичные антитела и длины волн DAPI и установите формат изображения до 1 024 на 1024 пикселей со средней линией восемь. Затем изображение каждого хорошо на четыре хорошо слайд под 100x цели. Для подсчета большого количества ячеек, получить пять-десять изображений из последовательных полей в том же хорошо под 40x цели.Чтобы проанализировать ядерное и цитоплазмическое распределение ICP0, откройте проект в программном обеспечении конфокального применения и выберите изображение. Откройте вкладку Количество и выберите сортировать регионы, представляющие интерес, из меню Инструменты. Выберите линию рисовать и нарисуйте продольную линию по всей ячейке для анализа.Гистограмма появится показаны флуоресценции интенсивности вдоль линии как для белка интереса, и DAPI. На основе фонового окрашивания установлен постоянный порог интенсивности белка, представляющий интерес для анализа субклеточного распределения белка в каждом эксперименте. Если белковый сигнал в среднем находится ниже порога в ядерной области, но выше порога за границей DAPI, классифицировать белковый сигнал как преимущественно расположенный в цитоплазме.Если белковый сигнал находится выше порога по всему ядру и за пределами границы сигнала DAPI, сгруппив белковый сигнал как ядро плюс цитоплазмическую локализацию. Если белковый сигнал выше порога в ядре, но в среднем находится ниже порога за пределами границы сигнальной группы DAPI, то белковый сигнал как ядерная локализация. Наконец, табулировать более 200 инфицированных клеток из каждой выборки в разных точках времени инфекции, и график данных в бар график, чтобы проиллюстрировать движение белка интереса с течением времени.Как было продемонстрировано, этот метод облегчает анализ ядерной к цитоплазмической транслокации белков, представляющих интерес. Например, инфицированный клеточный белок ноль, или субклеточное распределение ICP0 изменяется по мере развития вирусной инфекции. Чтобы понять элементы, необходимые для торговли ICP0 во время инфекции, движения ICP0 можно отслеживать в диких типах и мутантного типа герпеса Simplex Вирус 1-инфицированных клеток на различных стадиях инфекции, что позволяет оценки субклеточного распределения ICP0 в разные моменты времени инфекции.Важно помнить использовать монослойные культуры, чтобы вирилы имели равный доступ к клеткам и нормализовать множественность инфекции в соответствии с названием вируса, так что прогрессирование инфекции сопоставимо между вирусами и внутри них. После каждого развития, этот метод проложил путь для исследователей в области биологии и клеточной вирусологии, чтобы исследовать движение белка, изучая височную субклеточную локализацию белков, представляющих интерес в клеточной популяции.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Микроволновая печь Assisted экспресс-диагностики болезней растений Вирус помощью просвечивающей электронной микроскопии

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Обнаружение токсинного транслокации в хост цитозоля от поверхностного плазменного резонанса

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Первичная система культуры нейронов по изучению простого герпеса латентности вирусов и реактивации

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Выделение и анализ генома Единого Вирионы использованием &quot;Единое геномики Вирус&quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-иммунопреципитации белка мыши MX1 с вирусом гриппа А нуклеопротеидную

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Экс Vivo Заражение мышиных эпидермиса с вирусом простого герпеса типа 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Анализ<em&gt; Yersinia энтероколитные</em&gt; Эффектор Транслокация в клетки-хозяева с помощью Бета-лактамазы эффекторных Слияния

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...