Name: endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients at JoVE.com

Vi takker Paolo Braganò og Lisa Mathiasen, Ph.D. for deres gennemgang af analyse protokol metoden. Dario Winterton, MD ydede betydelig hjælp til at gennemgå manuskriptet til engelsk sprogkundskaber.

Protokollen gennemføres i henhold til de institutionelle retningslinjer for håndtering af humane bioprøver og efter de nuværende standard operative procedurer i vores kliniske laboratorium. Brugen af EA-data og kliniske oplysninger om patienter, der testes, følger retningslinjerne i vores institutions etiske komité for human forskning.
1. laboratorieudstyr og indhold af Analysesæt
<ol><li>Opbevar EA-kittet ved 2 – 8 °C, når det ikke er i brug.</li>
	<li>
Hver EA-test best?...

<ol>
	<li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signalling.">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li><li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems:+the+Toll-like+receptors.">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li><li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Natanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+and+tumor+necrosis+factor+challenges+in+dogs+simulate+the+cardiovascular+profile+of+human+septic+shock.">Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock.</a> The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).</li><li>Suffredini, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiovascular+response+of+normal+humans+to+the+administration+of+endotoxin.">The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin.</a> The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).</li><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-Negative+Severe+Sepsis:+Nationwide+Trends+and+Outcomes.">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li><li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients.">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li><li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Targeted+Polymyxin+B+Hemoperfusion+on+28-Day+Mortality+in+Patients+With+Septic+Shock+and+Elevated+Endotoxin+Level.">Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level.</a> The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+implications+of+endotoxemia+in+critical+illness:+results+of+the+MEDIC+study.">Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study.</a> The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).</li><li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clottable+protein+in+Limulus;+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin.">Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+endotoxin+activity+in+critically+ill+patients+using+whole+blood+neutrophil+dependent+chemiluminescence.">Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence.</a> Critical Care. 6 (4), 342-348 (2002).</li><li>Grimaldi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Level+of+Endotoxemia+Following+Out-of-Hospital+Cardiac+Arrest+Is+Associated+With+Severity+and+Duration+of+Postcardiac+Arrest+Shock.">High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock.</a> Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).</li><li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EUPHRATES+trial+(Evaluating+the+Use+of+Polymyxin+B+Hemoperfusion+in+a+Randomized+controlled+trial+of+Adults+Treated+for+Endotoxemia+and+Septic+shock):+study+protocol+for+a+randomized+controlled+trial.">The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial.</a> Trials. 15, 218 (2014).</li><li>Bottiroli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+early+high+Endotoxin+Activity+in+septic+shock:+An+observational+study.">Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study.</a> Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).</li><li>Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+related+to+severe+sepsis+and+septic+shock+among+critically+ill+patients+in+Australia+and+New+Zealand.">Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).</li><li>Biagioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+activity+levels+as+a+prediction+tool+for+risk+of+deterioration+in+patients+with+sepsis+not+admitted+to+the+intensive+care+unit:+a+pilot+observational+study.">Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study.</a> Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).</li><li>Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+detection+of+bacterial+endotoxin+in+plasma+with+the+Limulus+test.">Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test.</a> The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).</li><li>Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+intermediate+levels+of+the+Endotoxin+Activity+Assay+(EA)+with+other+biomarkers+in+the+assessment+of+patients+with+sepsis:+results+of+an+observational+study.">Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study.</a> Critical Care. 16 (3), (2012).</li><li>Earley, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+Injury+Alters+the+Intestinal+Microbiome+and+Increases+Gut+Permeability+and+Bacterial+Translocation.">Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation.</a> PLoS One. 10 (7), (2015).</li><li>Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidental+phenomenon+or+true+pathology?.">Incidental phenomenon or true pathology?.</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321 (1993).</li><li>Clementi, A., Virz&#236;, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5.">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li><li>Virz&#236;, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis:+Role+of+Endotoxin.">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li><li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients.">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li><li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients.">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li></ol>

Septisk Shock er stadig i dag forbundet med en dødelighed så højt som 40%, selv om denne sats varierer i henhold til de betragtede rapporter16. Behovet for nye og bedre biomarkører er anbefalet af de fleste eksperter på områderne for at hjælpe klinikere i tidlig diagnose, bedre ledelse og prognose af patienter med septisk chok6.
Udførelse af en EA-test kræver ikke tidligere teknisk viden eller sofistikeret laboratorieudstyr, og enhver su...

Lipopolysaccharid (LPS), også kendt som endotoxin, er en vigtig bestanddel af membran strukturen af gram-negative (GN) bakterier. Det udgør omkring 10% af cellevæggen, er afgørende for den ydre membran integritet og homøostase. Desuden er det en potent aktivator af værten medfødte immunsystem1,2.
In vitro eksponering af medfødte immunsystemceller til LPS fører til ændringer i ekspression af flere gener3. Indgivelse af meget små mængder af LPS hos raske humane frivillige udløser kaskade af akut systemisk inflammation, hvorimod sepsis og septisk Shock kan opstå med højere endotoksin koncentrationer4,5.
Sepsis er en livstruende tilstand, som, hvis det ikke straks anerkendes, kan føre til multi-organsvigt og død. Septiske patienter skal behandles rettidigt, med aggressiv genoplivning, tilstrækkelig antibiotikabehandling, optimal kilde kontrol, og hurtig organ støtte strategier. Diagnosen af etiologien af sepsis er primært baseret på klinisk anerkendelse og kultur baseret patogen detektion6. Men, resultaterne af mikrobielle kulturer kan tage op til 48 h og er inkonklusive i op til 30% af tilfældene7. Tidlig identificering og intervention kan føre til bedre patientresultater. Hos patienter, hvor der er mistanke om sepsis, træffes beslutninger ofte på grundlag af fysiologiske og biokemiske parametre uden et klart tegn på endotoxæmi.
Måling af endotoksin aktivitet (EA) kan opnås ved hjælp af en kommerciel analyse (Se tabel over materialer) i fuldblod. Det kan bruges som en biomarkør af systemisk endotoxæmi til tidlig stratificering af sygdommens sværhedsgrad, især hos patienter med risiko for at udvikle septisk Shock8. Analysen blev brugt til at vejlede polymyxin B hæmoperfusion terapi i et nyligt offentliggjort dobbelt-blind randomiseret-kontrolleret klinisk forsøg hos patienter med septisk Shock9. Hos kritisk syge patienter viste MEDIC-studiet øget EA-niveau for at være forbundet med flere organ dysfunktion, intensiv pleje enhed (ICU) opholdets længde og dødelighed10.
Forskellige assays er blevet udviklet til påvisning af endotoxin. Den Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay, enten som en gel-prop, turbidimetrisk, eller kromogen test, har hidtil været den hyppigst vedtagne til vurdering af serum endotoxin. Det er baseret på endotoksin evne til at fremkalde koagulation af hemolymh af hestesko krabbe, Limulus polyphemus. Men, denne analyse har nogle begrænsninger i form af specificitet. Især kan det også aktiveres af mikrobielle produkter, bortset fra endotoxin, såsom komponenter af svampe cellevæggen, og det kan hæmmes af forskellige humane plasmaproteiner11.
I løbet af det sidste årti er målingen af EA blevet udviklet og valideret som en biomarkør af cirkulerende endotoxæmi. Sammenlignet med LAL-testen er EA hurtigere og nemmere at implementere i de kliniske omgivelser. Desuden har det vist sig at være mere præcis end LAL i fuldblod, med øget følsomhed og specificitet, både in vitro og in vivo12.
På trods af sin oprindelige gennemførelse som et tidligt diagnostisk værktøj til hurtig identifikation af GN bakterier som sepsis kausative agenter, er EA-niveauet også blevet undersøgt som en biomarkør af sygdommens sværhedsgrad. I denne sammenhæng har det vist sig at være særlig nyttigt at vurdere hypoperfusion tilstand på grund af igangværende kritisk sygdom, såsom septisk Shock eller post-hjertestop syndrom13. For nylig, siden udviklingen af hemopurificering systemer, et positivt EA resultat er også blevet foreslået som et screeningsværktøj til præcist at identificere potentielle kandidater til en sådan behandling14. Vi har for nylig gennemført en observations retrospektiv undersøgelse af forekomsten og den kliniske signifikans af tidlige høje niveauer af EA hos 107 patienter med septisk Shock. I overensstemmelse med andre nylige resultater konstaterede vi, at EA er en lovende markør for sygdommens sværhedsgrad hos patienter med septisk Shock15.
Formålet med dette manuskript er at beskrive metoden til udførelse af EA-analysen, enten ved sengen eller i laboratoriet, og at beskrive dens potentielle anvendelse i et repræsentativt scenario med septisk Shock. Denne teknik kan detektere LPS aktivitet ved at måle den forbedrede oxidativ burst i neutrofiler efter deres priming af komplekser af en anti-endotoxin antistof og LPS. Den øgede respiratoriske eksplosion påvises ved et kemiluminometer, og mængden af det udsendte lys anses for proportional med mængden af endotoksin i blodprøven. Analysen kræver få reagenser, tager ca. 30 min til at udføre og bruger så lidt som 40 μL fuldblod12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:727px;" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">EAA kit</td>
			<td style="width:141px;">Spectral Medical Inc.</td>
			<td style="width:133px;">EAAST-20</td>
			<td style="width:268px;">Package with 20 tests + 1 quality control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Smart Line TL</td>
			<td style="width:141px;">Berthold</td>
			<td style="width:133px;">EAASL</td>
			<td>Luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:141px;">GRANT</td>
			<td style="width:133px;">ES-20</td>
			<td>Mini-incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Vortexer</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">444-2790</td>
			<td>Vortex instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients

Lipopolysaccharid, også kendt som endotoxin, er en grundlæggende bestanddel af gram-negative bakterier og spiller en afgørende rolle i udviklingen af sepsis og septisk chok. Tidlig identificering af en smitsom proces, der hurtigt udvikler sig til en kritisk sygdom, kan medføre en hurtigere og mere intensiv behandling og dermed potentielt føre til bedre patientresultater. Den endotoxin aktivitet (EA) assay kan anvendes ved sengen som en pålidelig biomarkør af systemisk endotoxæmi. Påvisning af forhøjede endotoksin-aktivitetsniveauer er gentagne gange blevet påvist at være forbundet med en øget sygdoms sværhedsgrad hos patienter med sepsis og septisk Shock. Analysen er hurtig og nem at udføre. Kort efterprøve udtagning blandes en alikvot fuldblod med et anti-endotoksit antistof og tilsat LPS. Endotoksin aktivitet måles som den relative oxidativ eksplosion af primede neutrofiler som påvist ved chemioluminescens. Analysens udgang udtrykkes på en skala fra 0 (fraværende) til 1 (maksimal) og kategoriseres som "lav" (< 0,4 enheder), "intermediært" (0,4 – 0,59 enheder) eller "høj" (≥ 0,6 enheder). Den detaljerede metodologi og begrundelse for gennemførelsen af EA-analysen rapporteres i dette manuskript.

En 72-årig mand blev optaget på skadestuen (ED) af et akademisk byhospital. Et par dage tidligere havde han præsenteret for sin primære pleje læge klager over afbrænding på vandladning. En kort behandlings behandling med oral foshomycin blev anbefalet. Hans sygehistorie omfattede hypertension, ukompliceret type-2 diabetes og benign prostatahyperplasi. Hans medicin inkluderede enalapril, atorvastatin, Tamsulosin og metformin.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Watch this Scientific Journal Video about Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients at JoVE.com

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Vi fremlægger hermed en protokol til måling af endotoksin aktivitet af humane fuldblodsprøver ved sengen. Den endotoxin aktivitet assay er en simpel test til at udføre og kan være en nyttig biomarkør hos kritisk syge patienter med sepsis.

Endotoxin-Aktivitetsanalyse til påvisning af fuldblods Endotoxæmi hos kritisk syge patienter

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Sepsis kan føre til multi-organsvigt og død. Endoksin er en grundlæggende bestanddel af gram-negative bakterier. Forhøjede cirkulerende niveauer af endoksin kan identificere patient med højere risiko for at udvikle en mere alvorlig sygdom.Endotoksin aktivitetsanalysen kan bruges som en enkel, hurtig og pålidelig biomarkør for systemisk endotoxæmi. Den tidlige påvisning af dette toksin kan hjælpe klinikere behandle patienter med septisk chok. Hos patient med septisk chok, tidlig identifikation af en hurtigt udviklende tilstand kan bede en hurtigere og mere intensiv liv støtte terapi, potentielt fører til bedre resultater.Påvisning af denne procedure vil det være Lisa Mathiasen, en molekylærbiolog, der samarbejder med vores forskningsgruppe. For at starte denne procedure skal du opstille et EA-testsæt og pakke de fem forskellige slags rør ud. Brug rør nummer et, kontrolrøret, til at måle den basale aktivitet af den ikke-specifikke oxidative burst af patientens neutrofiler i mangel af et bestemt antistof.Brug rør nummer to, prøverøret, til at måle den oxidative burst som reaktion på LPS-antistofkomplekset. Brug rør nummer tre, Max-røret, til at måle den maksimale oxidative eksplosion af patientens neutrofiler som reaktion på et overskud af endoksin. Brug rør nummer fire, LPS-røret, som en kilde til eksogen endoksin.Og brug rør nummer fem, Aliquot-røret, til blodopbevaring. Patientens blodprøver indsamles i sterile rør, der indeholder EDTA-antikoagulerende, og opbevar dem ved stuetemperatur, før EA-testen køres. Før testen startes, tændes chemiluminometeret og inkubatorshakeren, og inkubatoren opvarmes til 37 grader Celsius.Først skal du placere EA-rørene, der skal bruges i rørstativer, og fjerne hætterne. Brug en kombipipette til at overføre en milliliter EA-reagens fra flasken til rør nummer et, nummer to og nummer tre ved at pipettere siden af rørene ned. Forsigtigt vende blodopsamlingsrøret 20 gange for at blande patientens blodprøve.Derefter pipette 0,5 milliliter patientblod i rør nummer fire og rør nummer fem. Vortex rør nummer fire i 10 sekunder. Sæt rørstativerne med alle EA-reagensglassene i inkubatorshakeren.Luk låget, og inkubere ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Derefter åbnes inkubatorlåget, og rørstativerne fjernes fra rystemaskinen. Vortex rør nummer fem.Ved hjælp af en steril spids, pipette 40 mikroliter blod i rør nummer et og nummer to, i to eksemplarer. Vortex rør nummer fire. Ved hjælp af samme pipettespids overføres 40 mikroliter blod fra rør nummer fire til rør nummer tre i to eksemplarer.Vortex de seks sidste reagensglas en efter en. Sæt rørstativerne tilbage i den inkuberende shaker, og luk låget. Indstil shakeren til 100 omdrejninger i minuttet, og start bevægelsen i 14 minutter.Sæt EA-mærket chipkort i chemiluminometeret, og tryk på Start. Efter inkubationen på 14 minutter skal du følge anvisningerne på chemiluminometeret. Vortex hvert rør i 10 sekunder, før det anbringes på prøveholderen på chemiluminometeret.Åbn prøveskuffen, og sæt rør nummer et ind i prøveholderen. Luk derefter prøveskuffen, og vent på den relative lysenhedsaflæsning. Gentag denne læseproces for rør to og tre og alle dubletter, som beskrevet i tekstprotokollen.Når alle rørene er blevet behandlet, beregnes og udskrives EA-resultaterne automatisk. Gentag hele analysen proces for hver blodprøve, der skal testes. Opbevar EA Assay-sættet og dets komponenter i den originale forseglede pakke ved en temperatur mellem to og 25 grader Celsius.I denne undersøgelse udføres en endotoksinaktivitetsanalyse for at påvise blod endotoxæmi hos kritisk syge patienter. En EA-værdi på mindre end 0,40 EA-enheder angiver et lavt endotoksinaktivitetsniveau svarende til en lav cirkulerende LPS-koncentration, hvilket udgør en lav risiko for progression til en alvorlig sygdomstilstand. Et resultat mellem 0,40 og 0,59 EA-enheder indikerer et mellemliggende endotoksinaktivitetsniveau, som udgør en mellemliggende risiko for udvikling af svær sepsis og septisk chok.Resultater, der er lig med eller større end 0,60 EA-enheder, indikerer et højt endoksinaktivitetsniveau, hvilket udgør en høj risiko for septisk chok og dårlige patientresultater. Blod fra rør nummer fire og fem skal blandes med det korrekte reagensglas. Der skal være ekstra omhu for at følge den korrekte rækkefølge, der er angivet i protokollen.Hvert rør køres i dubletter, hvilket potentielt fører til fejl i denne fase. Efter introduktionen er EA-analysen blevet foreslået som biomarkør for risikostratificering af patienter med systemisk hypoperfusion. Det er også blevet undersøgt som en screeningtest for at udvælge patienter til avancerede hæmorensningsbehandlingsstrategier.

Research

JoVE Journal

Medicine

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

The healthy gastrointestinal tract is physiologically colonized by a large variety of commensal microbes that influence the development 
	of the humoral ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Hurtig Point-of-Care Assay af enoxaparin antikoagulerende effekt i fuldblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Real-time cytotoksicitetsassays i humant fuldblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Netværk Analyse af foramen ovale elektrode Optagelser i Drug-resistent TLE Patienter

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Hele genom sekventering af Candida glabrata for påvisning af markører af svampedræbende resistens

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

How to Administer Near-Infrared Spectroscopy in Critically ill Neonates, Infants, and Children

Sådan administreres nær-infrarød spektroskopi hos kritisk syge nyfødte, spædbørn og børn

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated ...

Infrared Thermography for the Detection of Changes in Brown Adipose Tissue Activity

Infrarød termografi til påvisning af ændringer i brun fedtvævsaktivitet

Measuring brown adipose tissue (BAT) activity by positron emission tomography computed tomography (PET-CT) via the accumulation of 18F-fluorodeoxyglucose ...