Name: endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients at JoVE.com

Vi takker Paolo Braganò og Lisa Mathiasen, Ph.D. for deres gjennomgang av analysen protokollen metodikk. Dario Winterton, MD gitt betydelig hjelp gjennom manuskriptet for engelskkunnskaper.

Protokollen er utført i henhold til institusjonelle retningslinjer knyttet til håndtering av menneskelig biospecimens og etter gjeldende standard operative prosedyrer i vårt kliniske laboratorium. Bruken av EA-data og klinisk informasjon om pasienter som testes, følger retningslinjene i vår institusjons komité for menneskelig forskning.
1. innhold i laboratorieutstyr og Analysesett
<ol><li>Oppbevar EA-settet ved 2 – 8 ° c når det ikke er i bruk.</li>
	<li>
Hver EA-test best...

<ol>
	<li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signalling.">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li><li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems:+the+Toll-like+receptors.">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li><li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Natanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+and+tumor+necrosis+factor+challenges+in+dogs+simulate+the+cardiovascular+profile+of+human+septic+shock.">Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock.</a> The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).</li><li>Suffredini, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiovascular+response+of+normal+humans+to+the+administration+of+endotoxin.">The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin.</a> The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).</li><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-Negative+Severe+Sepsis:+Nationwide+Trends+and+Outcomes.">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li><li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients.">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li><li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Targeted+Polymyxin+B+Hemoperfusion+on+28-Day+Mortality+in+Patients+With+Septic+Shock+and+Elevated+Endotoxin+Level.">Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level.</a> The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+implications+of+endotoxemia+in+critical+illness:+results+of+the+MEDIC+study.">Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study.</a> The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).</li><li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clottable+protein+in+Limulus;+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin.">Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+endotoxin+activity+in+critically+ill+patients+using+whole+blood+neutrophil+dependent+chemiluminescence.">Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence.</a> Critical Care. 6 (4), 342-348 (2002).</li><li>Grimaldi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Level+of+Endotoxemia+Following+Out-of-Hospital+Cardiac+Arrest+Is+Associated+With+Severity+and+Duration+of+Postcardiac+Arrest+Shock.">High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock.</a> Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).</li><li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EUPHRATES+trial+(Evaluating+the+Use+of+Polymyxin+B+Hemoperfusion+in+a+Randomized+controlled+trial+of+Adults+Treated+for+Endotoxemia+and+Septic+shock):+study+protocol+for+a+randomized+controlled+trial.">The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial.</a> Trials. 15, 218 (2014).</li><li>Bottiroli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+early+high+Endotoxin+Activity+in+septic+shock:+An+observational+study.">Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study.</a> Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).</li><li>Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+related+to+severe+sepsis+and+septic+shock+among+critically+ill+patients+in+Australia+and+New+Zealand.">Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).</li><li>Biagioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+activity+levels+as+a+prediction+tool+for+risk+of+deterioration+in+patients+with+sepsis+not+admitted+to+the+intensive+care+unit:+a+pilot+observational+study.">Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study.</a> Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).</li><li>Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+detection+of+bacterial+endotoxin+in+plasma+with+the+Limulus+test.">Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test.</a> The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).</li><li>Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+intermediate+levels+of+the+Endotoxin+Activity+Assay+(EA)+with+other+biomarkers+in+the+assessment+of+patients+with+sepsis:+results+of+an+observational+study.">Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study.</a> Critical Care. 16 (3), (2012).</li><li>Earley, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+Injury+Alters+the+Intestinal+Microbiome+and+Increases+Gut+Permeability+and+Bacterial+Translocation.">Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation.</a> PLoS One. 10 (7), (2015).</li><li>Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidental+phenomenon+or+true+pathology?.">Incidental phenomenon or true pathology?.</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321 (1993).</li><li>Clementi, A., Virz&#236;, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5.">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li><li>Virz&#236;, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis:+Role+of+Endotoxin.">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li><li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients.">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li><li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients.">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li></ol>

Den er fortsatt i dag forbundet med en dødelighet så høyt som 40%, selv om denne satsen varierer i henhold til de vurderte rapportene16. Behovet for romanen og bedre biomarkører er fremmet av de fleste eksperter på feltene for å hjelpe klinikere i tidlig diagnose, bedre styring, og prognostication av pasienter med elektrisk sjokk6.
Å utføre en EA-test krever ikke tidligere teknisk kunnskap eller sofistikert laboratorieutstyr, og alle hels...

Den lipopolysakkarid (LPS), også kjent som endotoksin, er en viktig del av membran strukturen av gram-negative (GN) bakterier. Det utgjør ca 10% av celle veggen, er avgjørende for den ytre membran integritet og homeostase. Videre er det en potent aktivator av verten medfødt immunsystem1,2.
In vitro eksponering av medfødte immunsystem celler til LPS fører til endringer i uttrykket av flere gener3. Administrasjon av svært små mengder av LPS i friske menneskelige frivillige utløser kaskade av akutt systemisk betennelse, mens sepsis og sjokk kan oppstå med høyere endotoksin konsentrasjoner4,5.
Sepsis er en livstruende tilstand som, hvis den ikke umiddelbart gjenkjennes, kan føre til svikt i flere orgel og død. Pasienter må behandles i tide, med aggressiv gjenoppliving, tilstrekkelig antibiotika behandling, optimal kildekontroll, og rask organ støtte strategier. Diagnosen av etiologi av sepsis er primært basert på klinisk anerkjennelse og kultur-baserte patogen deteksjon6. Resultatene av mikrobielle kulturer kan imidlertid ta opp til 48, og det er ikke svar på opptil 30% av tilfellene7. Tidlig identifisering og intervensjon kan føre til bedre pasient utfall. Hos pasienter hvor sepsis mistenkes, er beslutninger ofte gjort på grunnlag av fysiologiske og biokjemiske parametre, uten et klart tegn på endotoxemia.
Målingen av Endotoksin aktivitet (EA) kan fås ved hjelp av en kommersiell analyse (se tabell over materialer) i hele blodet. Den kan brukes som en biomarkør av systemisk endotoxemia for tidlig lagdeling av sykdom alvorlighetsgrad, spesielt hos pasienter med risiko for å utvikle sjokk8. Analysen ble brukt til å veilede Polymyxin B gemoperfuzia terapi i en nylig publisert dobbel-blind randomisert-kontrollerte klinisk studie hos pasienter med sjokk9. I kritisk syke pasienter viste MEDIC-studien økte EA-nivåer for å bli assosiert med flere organ dysfunksjon, intensivavdeling (ICU) lengde på oppholdet, og dødelighet10.
Ulike analyser er utviklet for å oppdage endotoksin. Den Limulus Amoebocyte Lysat (LAL) analysen, enten som en gel-Clot, turbidimetric, eller kromogen test, har vært så langt den hyppigst vedtatt for estimering av serum endotoksin. Den er basert på evnen til endotoksin å indusere blødnings av hemolymph av hestesko krabbe, Limulus Polyphemus. Men denne analysen har noen begrensninger i form av spesifisitet. Spesielt, det kan også aktiveres av mikrobielle produkter enn endotoksin, for eksempel komponenter av fungal celle veggen, og det kan bli hemmet av ulike humane plasmaproteiner11.
I løpet av det siste tiåret har målingen av EA blitt utviklet og validert som en biomarkør av sirkulerende endotoxemia. Sammenlignet med LAL testen, er EA raskere og enklere å implementere i den kliniske innstillingen. Videre har det vist seg å være mer nøyaktig enn LAL i hele blodet, med økt følsomhet og spesifisitet, både in vitro og in vivo12.
Til tross for sin første implementering som et tidlig diagnostisk verktøy for rask identifisering av GN bakterier som sepsis forårsaker agenter, har EA-nivået også blitt studert som en biomarkør av sykdom alvorlighetsgrad. I denne sammenheng har det vist seg å være spesielt nyttig for å vurdere Hypoperfusion tilstand på grunn av pågående kritisk sykdom, slik som sjokk eller post-hjertestans syndrom13. Mer nylig, siden utviklingen av hemopurification systemer, et positivt EA resultat har også blitt foreslått som et screening verktøy for å nøyaktig identifisere potensielle kandidater til slik behandling14. Vi har nylig gjennomført en observasjons retrospektiv studie om utbredelsen og klinisk betydning av tidlige høye nivåer av EA i 107 pasienter med sjokk. I tråd med andre nylige resultater, fant vi ut at EA er en lovende markør for sykdoms alvorlighetsgrad hos pasienter med sjokk15.
Målet med dagens manuskript er å beskrive metoden for å utføre EA analysen, enten ved sengen eller i laboratoriet, og for å beskrive sin potensielle bruk i et representativt scenario av sjokk. Denne teknikken kan oppdage LPS aktivitet ved å måle forbedret oksidativt utbrudd i nøytrofile etter deres grunning av komplekser av en anti-endotoksin antistoff og LPS. Den økte respirasjons mengden oppdages av en chemiluminometer, og mengden lys som slippes ut, anses som proporsjonal med endotoksin i Blodprøven. Analysen krever få reagenser, tar ca 30 min å utføre og bruker så lite som 40 μL av hele blod12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:727px;" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">EAA kit</td>
			<td style="width:141px;">Spectral Medical Inc.</td>
			<td style="width:133px;">EAAST-20</td>
			<td style="width:268px;">Package with 20 tests + 1 quality control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Smart Line TL</td>
			<td style="width:141px;">Berthold</td>
			<td style="width:133px;">EAASL</td>
			<td>Luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:141px;">GRANT</td>
			<td style="width:133px;">ES-20</td>
			<td>Mini-incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Vortexer</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">444-2790</td>
			<td>Vortex instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients

Lipopolysakkarid, også kjent som endotoksin, er en fundamental komponent av gram-negative bakterier og spiller en avgjørende rolle i utviklingen av sepsis og sjokk. Tidlig identifisering av en smittsom prosess som raskt utvikler seg til en kritisk sykdom, kan føre til raskere og mer intensiv behandling, noe som derved fører til bedre pasient utfall. Endotoksin Activity (EA)-analysen kan brukes ved sengen som en pålitelig biomarkør av systemisk endotoxemia. Påvisning av forhøyede endotoksin aktivitet nivåer har gjentatte ganger vist å være assosiert med en økt sykdom alvorlighetsgrad hos pasienter med sepsis og sjokk. Analysen er rask og enkel å utføre. Kort, etter prøvetaking, er en alikvot av hele blod blandet med et anti-endotoksin antistoff og med ekstra LPS. Endotoksin aktivitet måles som den relative oksidativt utbrudd av primet nøytrofile som oppdages av chemioluminescence. Analysen er output uttrykkes på en skala fra 0 (fraværende) til 1 (maksimal) og kategorisert som "lav" (< 0,4 enheter), "Intermediate" (0,4-0.59 enheter), eller "høy" (≥ 0,6 enheter). Den detaljerte metodikk og begrunnelse for gjennomføringen av EA analysen er rapportert i dette manuskriptet.

En 72 år gammel mann ble innlagt i Emergency Department (ED) av en akademisk urbane sykehus. Et par dager tidligere hadde han presentert for sin primære omsorg lege klaget over brenning ved vannlating. En kort-retters terapi med oral phosphomycin ble anbefalt. Hans medisinske historie inkluderte hypertensjon, ukomplisert type-2 diabetes og benign prostatahyperplasi. Hans medisiner inkluderte enalapril, Atorvastatin, tamsulosin og Metformin.
<p class="jove_content" fo:keep-together.w...

Watch this Scientific Journal Video about Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients at JoVE.com

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Vi presenterer herved en protokoll for å måle ved sengen den endotoksin aktiviteten av menneskelige hele blodprøver. Den Endotoksin aktivitet analysen er en enkel test for å utføre og kan være en nyttig biomarkør i kritisk syke pasienter med sepsis.

Endotoksin aktivitet analysen for påvisning av hele blod endotoxemia i kritisk syke pasienter

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Sepsis kan føre til multiorgansvikt og død. Endotoksinet er en grunnleggende komponent av gram-negative bakterier. Forhøyede sirkulerende nivåer av endotoksin kan identifisere pasienten med høyere risiko for å utvikle en mer alvorlig sykdom.Endotoxin Aktivitetsanalysen kan brukes som en enkel, rask og pålitelig biomarkør for systemisk endotoksemi. Tidlig påvisning av dette toksinet kan hjelpe klinikere som behandler pasienter med septisk sjokk. Hos pasienter med septisk sjokk kan tidlig identifisering av en raskt utviklende tilstand føre til en raskere og mer intensiv livsstøttebehandling, noe som potensielt kan føre til bedre resultater.Viser denne prosedyren vil være Lisa Mathiasen, en molekylær biolog som samarbeider med vår forskningsgruppe. For å starte denne prosedyren, sett ut et EA-testsett og pakk ut de fem forskjellige rørene. Bruk rør nummer én, kontrollrøret, for å måle basalaktiviteten til det ikke-spesifikke oksidative utbruddet av pasientens nøytrofiler i fravær av et bestemt antistoff.Bruk rør nummer to, prøverøret, til å måle oksidativt utbrudd som svar på LPS-antistoffkomplekset. Bruk rør nummer tre, Max-røret, for å måle det maksimale oksidative utbruddet av pasientens nøytrofiler som svar på et overskudd av endotoxin. Bruk rør nummer fire, LPS-røret, som en kilde til eksogene endotoksin.Og bruk rør nummer fem, Aliquot-røret, til blodlagring. Samle pasient blodprøver i sterile rør som inneholder EDTA antikoagulant, og lagre dem ved romtemperatur før du kjører EA-testen. Før du starter testen, slå på chemiluminometeret og inkubatorshakeren og varm inkubatoren til 37 grader Celsius.Plasser først EA-rørene som skal brukes i rørstativer, og fjern hettene. Bruk en kombipipette til å overføre én milliliter ea-reagens fra flasken til rør nummer én, nummer to og nummer tre ved å pipe ned på siden av rørene. Inverter forsiktig blodoppsamlingsrøret 20 ganger for å blande pasientens blodprøve.Deretter pipette 0,5 milliliter pasient blod i rør nummer fire og rør nummer fem. Vortex tube nummer fire i 10 sekunder. Plasser rørstativene med alle EA-reagensrørene i inkubatorshakeren.Lukk lokket, og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Etter dette åpner du inkubatorlokket og fjerner rørstativene fra risteren. Vortex tube nummer fem.Ved hjelp av en steril spiss, pipette 40 mikroliter blod i rør nummer én og nummer to, i duplikat. Vortex rør nummer fire. Bruk samme pipettespiss, overfør 40 mikroliter blod fra rør nummer fire til rør nummer tre, i duplikat.Vortex de seks siste testrørene en etter en. Plasser rørstativene tilbake i inkuberingsristeren, og lukk lokket. Sett risten på 100 o/min, og start bevegelsen i 14 minutter.Sett ea-merket chipkort inn i kjemiluminometeret, og trykk på Start. Etter den 14-minutters inkubasjonen følger du instruksjonene som vises på kjemiluminometeret. Virvle forsiktig hvert rør i 10 sekunder før du plasserer det på prøveholderen på kjemiluminometeret.Åpne prøveskuffen, og plasser rør nummer én i prøveholderen. Lukk deretter prøveskuffen, og vent til den relative lysenheten skal leses. Gjenta denne leseprosessen for rør to og tre og alle duplikater, som beskrevet i tekstprotokollen.Etter at alle rørene er behandlet, beregnes og skrives EA-resultatene ut automatisk. Gjenta hele analyseprosessen for hver blodprøve som må testes. Oppbevar EA-analysesettet og komponentene i den originale forseglede pakken ved en temperatur mellom to og 25 grader Celsius.I denne studien utføres en Endotoxin Activity Assay for å oppdage fullblods endotoksemi hos kritisk syke pasienter. En EA-verdi på mindre enn 0,40 EA-enheter indikerer et lavt endotoksinaktivitetsnivå, tilsvarende en lav sirkulerende LPS-konsentrasjon, noe som representerer lav risiko for progresjon til alvorlig sykdomstilstand. Et resultat mellom 0,40 og 0,59 EA-enheter indikerer et mellomliggende endotoksinaktivitetsnivå, noe som representerer en mellomliggende risiko for utvikling av alvorlig sepsis og septisk sjokk.Resultater tilsvarende eller større enn 0,60 EA-enheter indikerer et høyt endotoksaktivitetsnivå, noe som representerer en høy risiko for septisk sjokk og dårlige pasientutfall. Blod fra rør nummer fire og fem må blandes med riktig testrør. Ekstra forsiktighet må tas for å følge riktig rekkefølge som er angitt i protokollen.Hvert rør kjøres i duplikater, noe som potensielt fører til feil i denne fasen. Etter introduksjonen har EA-analysen blitt foreslått som biomarkør for risikostratifisering av pasienten med systemisk hypoperfusjon. Det har også blitt studert som en screeningtest for å velge pasienter for avanserte hemopurification behandlingsstrategier.

Research

JoVE Journal

Medicine

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

The healthy gastrointestinal tract is physiologically colonized by a large variety of commensal microbes that influence the development 
	of the humoral ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Rapid Point-of-Care-analysen av Enoksaparin Antikoagulerende Effekt i fullblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Real-time cytotoksisitetsanalyser i humant fullblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Network Analyse av foramen ovale elektrode Recordings i resistent tinninglappen epilepsipasienter

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Hele genomet sekvensering av Candida glabrata for gjenkjenning av markører av soppdrepende resistens

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

How to Administer Near-Infrared Spectroscopy in Critically ill Neonates, Infants, and Children

Hvordan administrere nær-infrarød spektroskopi i kritisk syke nyfødte, spedbarn og barn

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated ...

Infrared Thermography for the Detection of Changes in Brown Adipose Tissue Activity

Infrarød termografi for påvisning av endringer i brunt fettvevsaktivitet

Measuring brown adipose tissue (BAT) activity by positron emission tomography computed tomography (PET-CT) via the accumulation of 18F-fluorodeoxyglucose ...