Name: endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00
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Agradecemos a Paolo Braganò e a Lisa Mathiasen, Ph.D. pela revisão da metodologia do protocolo de ensaio. Dario WINTERTON, MD forneceu ajuda substancial rever o manuscrito para proficiência em língua inglesa.

O protocolo é conduzido de acordo com as diretrizes institucionais relativas ao manuseio de bioespécimes humanos e seguindo os procedimentos operativos padrão atuais do nosso laboratório clínico. O uso de dados da EA e informações clínicas dos pacientes que estão sendo testados seguem as diretrizes do Comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição.
1. conteúdo do equipamento de laboratório e do kit de ensaio
<ol><li>Guarde o kit EA a 2 – 8 ° c quando não estiver a...

<ol>
	<li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signalling.">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li><li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems:+the+Toll-like+receptors.">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li><li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiovascular+response+of+normal+humans+to+the+administration+of+endotoxin.">The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin.</a> The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).</li><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-Negative+Severe+Sepsis:+Nationwide+Trends+and+Outcomes.">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li><li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients.">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li><li>Dellinger, R. 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M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidental+phenomenon+or+true+pathology?.">Incidental phenomenon or true pathology?.</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321 (1993).</li><li>Clementi, A., Virz&#236;, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5.">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li><li>Virz&#236;, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis:+Role+of+Endotoxin.">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li><li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients.">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li><li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients.">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li></ol>

O choque séptico ainda hoje está associado a uma mortalidade tão alta quanto 40%, embora essa taxa varie de acordo com os relatos considerados16. A necessidade de novos e melhores biomarcadores é defendida pela maioria dos especialistas nos campos, a fim de auxiliar os clínicos no diagnóstico precoce, melhor manejo e prognosticação de pacientes com choque séptico6.
Realizar um teste de EA não requer conhecimento técnico prévio ou equi...

O lipopolissacarídeo (LPS), também conhecido como endotoxina, é um componente chave da estrutura da membrana de bactérias Gram-negativas (GN). Compõe-se cerca de 10% da parede celular, sendo vital para a integridade da membrana externa e homeostase. Além disso, é um ativador potente do sistema imunológico inata do hospedeiro1,2.
A exposição in vitro de células inatas do sistema imunológico a LPS leva a alterações na expressão de múltiplos genes3. A administração de quantidades muito pequenas de LPs em voluntários humanos saudáveis desencadeia a cascata de inflamação sistêmica aguda, enquanto a sepse e choque séptico podem surgir com maiores concentrações de endotoxina4,5.
A sepse é uma condição de risco de vida que, se não prontamente reconhecida, pode levar a falência de múltiplos órgãos e morte. Os pacientes sépticos devem ser tratados em tempo hábil, com ressuscitação agressiva, antibioticoterapia adequada, controle de fonte ideal e estratégias de apoio a órgãos. O diagnóstico da etiologia do sepsis é baseado primeiramente no reconhecimento clínico e na deteção cultura-baseada do micróbio patogénico6. No entanto, os resultados das culturas microbianas podem levar até 48 h e são inconclusivos em até 30% dos casos7. A identificação precoce e a intervenção podem levar a melhores resultados do paciente. Em pacientes em que a sepse é suspeita, as decisões são muitas vezes feitas com base em parâmetros fisiológicos e bioquímicos, sem um sinal claro de endotoxemia.
A medição da atividade da endotoxina (EA) pode ser obtida por meio de um ensaio comercial (ver tabela de materiais) em sangue total. Pode ser utilizado como biomarcador de endotoxemia sistêmica para a estratificação precoce da severidade da doença, particularmente em pacientes com risco de desenvolver choque séptico8. O teste foi usado para guiar a terapia do hemoperfusion de Polymyxin B em um ensaio clínico aleatorizado-controlado duplo-cego recentemente publicado nos pacientes com choque séptico9. Em pacientes criticamente enfermos, o estudo do MEDIC mostrou aumento dos níveis de EA para estar associado a disfunção de múltiplos órgãos, tempo de permanência na unidade de terapia intensiva (UTI) e mortalidade10.
Diferentes ensaios foram desenvolvidos para detectar endotoxina. O ensaio Limulus Amoebocyte lysate (LAL), seja como um teste de Gel-coágulo, turbidimétrico ou cromogênico, tem sido até agora o mais freqüentemente adotado para a estimativa da endotoxina sérica. Baseia-se na capacidade de endotoxina para induzir a coagulação da hemolinfa do caranguejo em ferradura, Limulus Polyphemus. No entanto, este ensaio tem algumas limitações em termos de especificidade. Em particular, ele também pode ser ativado por produtos microbianos que não seja endotoxina, tais como componentes da parede celular fúngica, e pode ser inibida por várias proteínas plasmáticas humanas11.
Durante a última década, a medida da EA foi desenvolvida e validada como um biomarcador de endotoxemia circulante. Comparado ao teste LAL, a EA é mais rápida e fácil de implementar no ambiente clínico. Além disso, demonstrou-se ser mais acurado que a LAL em sangue total, com sensibilidade e especificidade aumentadas, tanto in vitro como in vivo12.
Apesar de sua aplicação inicial como uma ferramenta diagnóstica adiantada para a identificação rápida de bactérias do GN como agentes causais do sepsis, o nível do ea foi estudado igualmente como um biomarcador da severidade da doença. Neste contexto, demonstrou-se ser particularmente útil avaliar o estado de hipoperfusão devido à doença crítica em curso, como choque séptico ou síndrome pós-parada cardíaca13. Mais recentemente, desde o desenvolvimento de sistemas de hemopurificação, um resultado positivo da EA também tem sido proposto como uma ferramenta de triagem para identificar com precisão potenciais candidatos para tal terapia14. Recentemente, realizou-se um estudo observacional retrospectivo sobre a prevalência e o significado clínico dos altos níveis iniciais de EA em 107 pacientes com choque séptico. Em consonância com outros resultados recentes, verificou-se que a EA é um marcador promissor de severidade da doença em pacientes com choque séptico15.
O objetivo do presente manuscrito é descrever o método de realização do ensaio EA, seja à beira do leito ou em laboratório, e descrever seu potencial de uso em um cenário representativo de choque séptico. Esta técnica pode detectar a atividade de LPS medindo o estouro oxidativo realçado nos neutrófilos que seguem seu priming por complexos de um anticorpo da antiendotoxina e de LPS. O aumento da ruptura respiratória é detectado por um quimiluminômetro e a quantidade de luz emitida é considerada proporcional à quantidade de endotoxina na amostra de sangue. O ensaio requer poucos reagentes, leva cerca de 30 min para executar e usa tão pouco como 40 μL de sangue total12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:727px;" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">EAA kit</td>
			<td style="width:141px;">Spectral Medical Inc.</td>
			<td style="width:133px;">EAAST-20</td>
			<td style="width:268px;">Package with 20 tests + 1 quality control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Smart Line TL</td>
			<td style="width:141px;">Berthold</td>
			<td style="width:133px;">EAASL</td>
			<td>Luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:141px;">GRANT</td>
			<td style="width:133px;">ES-20</td>
			<td>Mini-incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Vortexer</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">444-2790</td>
			<td>Vortex instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients

Lipopolissacaríno, também conhecido como endotoxina, é um componente fundamental das bactérias Gram-negativas e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da sepse e choque séptico. A identificação adiantada de um processo infeccioso que esteja evoluindo ràpida a uma doença crítica pôde alertar um tratamento mais rápido e mais intensivo, desse modo potencial conduzindo aos melhores resultados pacientes. O ensaio da atividade da endotoxina (ea) pode ser usado na cabeceira como um biomarcador de confiança do endotoxemia sistemático. A deteção de níveis elevados da atividade da endotoxina foi mostrada repetidamente para ser associada com uma severidade aumentada da doença nos pacientes com sepsis e choque séptico. O ensaio é rápido e fácil de executar. Brevemente, após a amostragem, uma alíquota de sangue total é misturada com um anticorpo antiendotoxina e com LPS adicionado. A atividade da endotoxina é medida como a explosão oxidativa relativa de neutrófilos primados como detectado pela chemioluminescência. A saída do ensaio é expressa em uma escala de 0 (ausente) para 1 (máximo) e categorizada como "baixa" (< 0,4 unidades), "intermediário" (0,4 – 0,59 unidades), ou "alta" (≥ 0,6 unidades). A metodologia detalhada e a justificativa para a implementação do ensaio EA são relatadas neste manuscrito.

Um homem dos anos de idade 72 foi admitido ao departamento da emergência (ED) de um hospital urbano académico. Poucos dias antes, ele tinha apresentado ao seu médico de cuidados primários reclamando de queima em micção. Uma terapia do short-curso com Fosfomicina oral foi recomendada. Sua história médica incluiu a hipertensão, o diabetes tipo-2 uncomplicated e a hiperplasia prostática benigna. Seus medicamentos incluíram Enalapril, Atorvastatina, Tamsulosin e metformina.
<p ...

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Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Nós apresentamos um protocolo para medir na cabeceira a atividade da endotoxina de amostras de sangue inteiras humanas. O ensaio da atividade da endotoxina é um teste simples a executar e pode ser um biomarcador útil em pacientes criticamente doentes com sepsis.

Ensaio da atividade da endotoxina para a deteção do endotoxemia do sangue inteiro em pacientes criticamente doentes

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

A sepse pode levar à falência e morte de vários órgãos. A endotoxina é um componente fundamental das bactérias gram-negativas. Níveis elevados de endotoxina podem identificar pacientes com maior risco para desenvolver uma doença mais grave.O ensaio de atividade de endotoxina pode ser usado como um biomarcador simples, rápido e confiável de endotoxemia sistêmica. A detecção precoce dessa toxina pode ajudar os médicos a tratar pacientes com choque séptico. Em paciente com choque séptico, a identificação precoce de uma condição em rápida evolução pode levar a uma terapia de suporte de vida mais rápida e intensiva, potencialmente levando a melhores resultados.Demonstrando esse procedimento estará Lisa Mathiasen, bióloga molecular que colabora com nosso grupo de pesquisa. Para iniciar este procedimento, defina um kit de teste EA e desempacotar os cinco tipos diferentes de tubos. Use o tubo número um, o tubo de controle, para medir a atividade basal da explosão oxidativa não específica dos neutrófilos do paciente na ausência de um anticorpo específico.Use o tubo número dois, o tubo amostral, para medir a explosão oxidativa em resposta ao complexo de anticorpos LPS. Use o tubo número três, o tubo Max, para medir a explosão oxidativa máxima dos neutrófilos do paciente em resposta a um excesso de endotoxina. Use o tubo número quatro, o tubo LPS, como fonte de endotoxina exógena.E use o tubo número cinco, o tubo de Aliquot, para armazenamento de sangue. Colete amostras de sangue do paciente em tubos estéreis contendo anticoagulantes EDTA e armazene-as à temperatura ambiente antes de executar o teste EA. Antes de iniciar o teste, ligue o quimiluminômetro e o shaker da incubadora e aqueça a incubadora a 37 graus Celsius.Primeiro, coloque os tubos EA para serem usados em racks de tubo e remova as tampas. Use uma combipipette para transferir um mililitro do reagente EA da garrafa para os tubos número um, número dois e número três, pipetando para baixo na lateral dos tubos. Inverta suavemente o tubo de coleta de sangue 20 vezes para misturar a amostra de sangue do paciente.Em seguida, pipeta 0,5 mililitros de sangue do paciente em tubo número quatro e tubo número cinco. Tubo vórtice número quatro por 10 segundos. Coloque os racks de tubo com todos os tubos de ensaio EA no agitador da incubadora.Feche a tampa e incuba a 37 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, abra a tampa da incubadora e remova os racks do tubo do agitador. Tubo de vórtice número cinco.Usando uma ponta estéril, pipeta 40 microliters de sangue em tubos número um e número dois, em duplicata. Tubo vórtice número quatro. Usando a mesma ponta de pipeta, transfira 40 microliters de sangue do tubo número quatro para o tubo número três, em duplicata.Vórtice os seis tubos de teste finais um por um. Coloque os racks de tubo de volta no agitador de incubação e feche a tampa. Coloque o agitador a 100 rpm, e inicie o movimento por 14 minutos.Insira o chipcard rotulado EA no quimiluminômetro e pressione Start. Após a incubação de 14 minutos, siga as instruções exibidas no chemiluminômetro. Vórtice suavemente cada tubo por 10 segundos antes de colocá-lo no suporte de amostra do chemiluminômetro.Abra a gaveta de amostras e coloque o tubo número um no suporte da amostra. Em seguida, feche a gaveta de amostras e aguarde a leitura da unidade de luz relativa. Repita este processo de leitura para tubos dois e três e todas as duplicatas, conforme descrito no protocolo de texto.Depois de todos os tubos terem sido processados, os resultados da EA serão calculados e impressos automaticamente. Repita todo o processo de ensaio para cada amostra de sangue que precisa ser testada. Armazene o kit de ensaio escrivão EA e seus componentes no pacote original lacrado a uma temperatura entre dois e 25 graus Celsius.Neste estudo, um ensaio de atividade de endotoxina é realizado para detectar endototoximia sanguínea total em pacientes gravemente doentes. Um valor EA inferior a 0,40 unidades EA indica um baixo nível de atividade endotoxina, igual a uma baixa concentração de LPS circulante, o que representa um baixo risco de progressão para um estado grave da doença. Um resultado entre unidades de 0,40 e 0,59 EA indica um nível intermediário de atividade de endotoxina, o que representa um risco intermediário para o desenvolvimento de sepse grave e choque séptico.Resultados iguais ou superiores a 0,60 unidades EA indicam um alto nível de atividade de endotoxina, o que representa um alto risco de choque séptico e desfechos ruins para os pacientes. O sangue dos tubos número quatro e cinco deve ser misturado com o tubo de ensaio correto. Deve-se tomar cuidado extra para seguir a ordem correta indicada no protocolo.Todos os tubos são executados em duplicatas, potencialmente levando a erros nesta fase. Após sua introdução, o Ensaio EA foi proposto como biomarcador para a estratificação de risco do paciente com hipoperfusão sistêmica. Além disso, tem sido estudado como um teste de triagem para selecionar pacientes para estratégias avançadas de tratamento de hemopurificação.

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	of the humoral ...

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How to Administer Near-Infrared Spectroscopy in Critically ill Neonates, Infants, and Children

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Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated ...

Infrared Thermography for the Detection of Changes in Brown Adipose Tissue Activity

Termografia infravermelha para detecção de alterações na atividade do tecido adiposo marrom

Measuring brown adipose tissue (BAT) activity by positron emission tomography computed tomography (PET-CT) via the accumulation of 18F-fluorodeoxyglucose ...