Name: endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients at JoVE.com

Vi tackar Paolo Braganò och Lisa Mathiasen, Ph.D. för deras granskning av analysen protokoll metodik. Dario Winterton, MD gav betydande hjälp att granska manuskriptet för engelska språkfärdighet.

Protokollet genomförs i enlighet med de institutionella riktlinjer som gäller hantering av Human biospecimen och efter de nuvarande standard operativa procedurerna i vårt kliniska laboratorium. Användningen av EA-data och klinisk information om patienter som testas följer riktlinjerna i vår institutions etikkommitté för mänskliga forskningsfrågor.
1. laboratorieutrustning och innehåll i Analyskit
<ol><li>Förvara EA-kitet vid 2 – 8 ° c när det inte används.</li>
	<li>
<strong...

<ol>
	<li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signalling.">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li><li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems:+the+Toll-like+receptors.">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li><li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Natanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+and+tumor+necrosis+factor+challenges+in+dogs+simulate+the+cardiovascular+profile+of+human+septic+shock.">Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock.</a> The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).</li><li>Suffredini, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiovascular+response+of+normal+humans+to+the+administration+of+endotoxin.">The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin.</a> The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).</li><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-Negative+Severe+Sepsis:+Nationwide+Trends+and+Outcomes.">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li><li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients.">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li><li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Targeted+Polymyxin+B+Hemoperfusion+on+28-Day+Mortality+in+Patients+With+Septic+Shock+and+Elevated+Endotoxin+Level.">Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level.</a> The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+implications+of+endotoxemia+in+critical+illness:+results+of+the+MEDIC+study.">Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study.</a> The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).</li><li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clottable+protein+in+Limulus;+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin.">Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+endotoxin+activity+in+critically+ill+patients+using+whole+blood+neutrophil+dependent+chemiluminescence.">Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence.</a> Critical Care. 6 (4), 342-348 (2002).</li><li>Grimaldi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Level+of+Endotoxemia+Following+Out-of-Hospital+Cardiac+Arrest+Is+Associated+With+Severity+and+Duration+of+Postcardiac+Arrest+Shock.">High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock.</a> Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).</li><li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EUPHRATES+trial+(Evaluating+the+Use+of+Polymyxin+B+Hemoperfusion+in+a+Randomized+controlled+trial+of+Adults+Treated+for+Endotoxemia+and+Septic+shock):+study+protocol+for+a+randomized+controlled+trial.">The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial.</a> Trials. 15, 218 (2014).</li><li>Bottiroli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+early+high+Endotoxin+Activity+in+septic+shock:+An+observational+study.">Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study.</a> Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).</li><li>Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+related+to+severe+sepsis+and+septic+shock+among+critically+ill+patients+in+Australia+and+New+Zealand.">Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).</li><li>Biagioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+activity+levels+as+a+prediction+tool+for+risk+of+deterioration+in+patients+with+sepsis+not+admitted+to+the+intensive+care+unit:+a+pilot+observational+study.">Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study.</a> Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).</li><li>Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+detection+of+bacterial+endotoxin+in+plasma+with+the+Limulus+test.">Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test.</a> The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).</li><li>Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+intermediate+levels+of+the+Endotoxin+Activity+Assay+(EA)+with+other+biomarkers+in+the+assessment+of+patients+with+sepsis:+results+of+an+observational+study.">Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study.</a> Critical Care. 16 (3), (2012).</li><li>Earley, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+Injury+Alters+the+Intestinal+Microbiome+and+Increases+Gut+Permeability+and+Bacterial+Translocation.">Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation.</a> PLoS One. 10 (7), (2015).</li><li>Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidental+phenomenon+or+true+pathology?.">Incidental phenomenon or true pathology?.</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321 (1993).</li><li>Clementi, A., Virz&#236;, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5.">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li><li>Virz&#236;, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis:+Role+of+Endotoxin.">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li><li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients.">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li><li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients.">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li></ol>

Septisk chock är fortfarande idag förknippad med en dödlighet så hög som 40%, även om denna kurs varierar enligt de övervägde rapporter16. Behovet av nya och bättre biomarkörer förespråkas av de flesta experter inom områdena för att hjälpa kliniker i tidig diagnos, bättre förvaltning och Prognosticering av patienter med septisk chock6.
Att utföra ett EA-test kräver inte tidigare teknisk kunskap eller sofistikerad laboratorieutr...

Lipopolysackarid (LPS), även känd som endotoxin, är en viktig del av membranstruktur gramnegativa (GN) bakterier. Det utgör cirka 10% av cellväggen, är avgörande för den yttre membranet integritet och homeostas. Dessutom, det är en potent aktivator av värd medfödda immunförsvaret1,2.
In vitro exponering av medfödda immunsystemet celler till LPS leder till förändringar i uttrycket av flera gener3. Administrering av mycket små mängder LP-skivor hos friska frivilliga försökspersoner utlöser en kaskad av akut systemisk inflammation, medan sepsis och septisk chock kan uppkomma med högre endotoxkoncentrationer4,5.
Sepsis är ett livshotande tillstånd som, om det inte omedelbart erkänns, kan leda till flera organ misslyckande och död. Septiska patienter måste behandlas i tid, med aggressiv återupplivning, adekvat antibiotikabehandling, optimal källkontroll, och snabba organ stödstrategier. Diagnosen av sepsis är främst baserad på klinisk igenkänning och kulturbaserad patogen detektion6. Resultaten av mikrobiella kulturer kan dock ta upp till 48 h och är ofullständiga i upp till 30% av fallen7. Tidig identifiering och intervention kan leda till bättre patientresultat. Hos patienter i vilka sepsis misstänks fattas ofta beslut på grundval av fysiologiska och biokemiska parametrar, utan ett tydligt tecken på endotoxemi.
Mätningen av Endotoxinaktiviteten (EA) kan erhållas med hjälp av en kommersiell analys (se tabell över material) i helblod. Det kan användas som en biomarkör av systemisk endotoxemia för tidig stratifiering av sjukdomens svårighetsgrad, särskilt hos patienter med risk för att utveckla septisk chock8. Analysen användes för att vägleda polymyxin B hemoperfusion terapi i en nyligen publicerad dubbelblind randomiserad kontrollerad klinisk prövning hos patienter med septisk chock9. Hos kritiskt sjuka patienter visade MEDIC-studien ökade EA-nivåer för att associeras med multipel organdysfunktion, intensivvårdsenhet (ICU) vistelsens längd och mortalitet10.
Olika analyser har utvecklats för att detektera endotoxin. Den Limulus Amoebocyte lysate (LAL) assay, antingen som en gel-propp, turbidimetriska, eller kromogena test, har hittills den mest förekommande för uppskattning av serum endotoxin. Den är baserad på förmågan hos endotoxin att inducera koagulering av hemolymfa av hästsko krabba, Limulus Polyfemos. Emellertid, denna analys har vissa begränsningar när det gäller specificitet. I synnerhet kan det också aktiveras av andra mikrobiella produkter än endotoxin, såsom komponenter i svamp cellväggen, och det kan hämmas av olika humana plasmaproteiner11.
Under det senaste decenniet har mätningen av EA utvecklats och validerats som en biomarkör för cirkulerande endotoxemi. Jämfört med LAL-testet är EA snabbare och enklare att implementera i den kliniska miljön. Dessutom, det har visat sig vara mer exakt än LAL i helblod, med ökad känslighet och specificitet, både in vitro-och in vivo12.
Trots sin första implementering som ett tidigt diagnostiskt verktyg för snabb identifiering av GN bakterier som sepsis smittämnen, har EA-nivån också studerats som en biomarkör för sjukdoms svårighetsgrad. I detta sammanhang har det visat sig vara särskilt användbart för att bedöma hypoperfusion tillstånd på grund av pågående kritisk sjukdom, såsom septisk chock eller efter hjärtstillestånd syndrom13. På senare tid, sedan utvecklingen av hemorenings system, ett positivt EA-resultat har också föreslagits som ett screening verktyg för att exakt identifiera potentiella kandidater för sådan behandling14. Vi genomförde nyligen en observationell retrospektiv studie om prevalensen och den kliniska betydelsen av tidiga höga nivåer av EA hos 107 patienter med septisk chock. I linje med andra nya resultat fann vi att EA är en lovande markör för sjukdomens svårighetsgrad hos patienter med septisk chock15.
Syftet med föreliggande manuskript är att beskriva metoden för att utföra EA-analysen, antingen vid sängen eller i laboratoriet, och för att beskriva dess potentiella användning i ett representativt scenario av septisk chock. Denna teknik kan upptäcka LPS aktivitet genom att mäta den förbättrade oxidativa burst i neutrofiler efter deras grundning av komplex av en anti-endotoxin antikropp och LP-skivor. Den ökade andnings bristningen upptäcks av en kemiluminometer och mängden utsänt ljus anses proportionell mot mängden endotoxin i blodprovet. Analysen kräver några reagens, tar ca 30 min att utföra och använder så lite som 40 μL av helblod12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:727px;" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">EAA kit</td>
			<td style="width:141px;">Spectral Medical Inc.</td>
			<td style="width:133px;">EAAST-20</td>
			<td style="width:268px;">Package with 20 tests + 1 quality control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Smart Line TL</td>
			<td style="width:141px;">Berthold</td>
			<td style="width:133px;">EAASL</td>
			<td>Luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:141px;">GRANT</td>
			<td style="width:133px;">ES-20</td>
			<td>Mini-incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Vortexer</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">444-2790</td>
			<td>Vortex instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients

Lipopolysackarid, även känd som endotoxin, är en fundamental del av gramnegativa bakterier och spelar en avgörande roll i utvecklingen av sepsis och septisk chock. Tidig identifiering av en smittsam process som snabbt utvecklas till en kritisk sjukdom kan leda till en snabbare och intensivare behandling och därmed potentiellt leda till bättre patientresultat. Endotoxin Activity (EA)-analysen kan användas vid sängen som en tillförlitlig biomarkör för systemisk endotoxemi. Detektion av förhöjda endotoxin aktivitetsnivåer har upprepade gånger visat sig vara förknippade med en ökad sjukdoms svårighetsgrad hos patienter med sepsis och septisk chock. Analysen är snabb och enkel att utföra. Kort efter provtagning blandas en alikvot av helblod med en anti-endotoxin-antikropp och med tillsats av LP-skivor. Endotoxin aktivitet mäts som den relativa oxidativa explosion av primade neutrofiler som upptäcks av chemioluminescence. Analysens utdata uttrycks på en skala från 0 (frånvarande) till 1 (maximal) och kategoriseras som "låg" (< 0,4 enheter), "mellanliggande" (0,4 – 0,59 enheter), eller "hög" (≥ 0,6 enheter). Den detaljerade metoden och motivet för genomförandet av EA-analysen rapporteras i detta manuskript.

En 72-årig man var antagen till akutavdelningen (ED) av ett akademiskt urbant sjukhus. Några dagar tidigare hade han presenterat för sin primärvårdsläkare klagar bränning på urinering. En kort-kurs terapi med oral phosphomycin rekommenderades. Hans sjukdomshistoria inkluderade hypertoni, okomplicerad typ 2-diabetes och benign prostatahyperplasi. Hans mediciner inkluderade enalapril, atorvastatin, tamsulosin och metformin.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Watch this Scientific Journal Video about Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients at JoVE.com

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Vi lägger härmed fram ett protokoll för mätning vid sängen av endotoxinhaltig aktivitet av mänskliga helblod prov. Endotoxin Activity assay är ett enkelt test för att prestera och kan vara en användbar biomarkör hos kritiskt sjuka patienter med sepsis.

Endotoxin aktivitet analys för detektion av helblod endotoxemia hos kritiskt sjuka patienter

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Sepsis kan leda till multi-organsvikt och död. Endotoxinet är en grundkomponent i gramnegativa bakterier. Förhöjda cirkulerande nivåer av endotoxin kan identifiera patienten med högre risk att utveckla en allvarligare sjukdom.Endotoxin activity assay kan användas som en enkel, snabb, och tillförlitlig biomarkör för systemisk endotoxemi. Tidig upptäckt av detta toxin kan hjälpa kliniker som behandlar patienter med septisk chock. Hos patienten med septisk chock, tidig identifiering av ett snabbt föränderligt tillstånd kan föranleda en snabbare och mer intensiv livsuppehållande terapi, vilket kan leda till bättre resultat.Visar detta förfarande kommer att Lisa Mathiasen, en molekylär biolog som samarbetar med vår forskargrupp. För att påbörja detta förfarande, ange en EA testkit och packa upp de fem olika typer av rör. Använd rör nummer ett, Control-röret, för att mäta basalaktiviteten hos den icke-specifika oxidativa sprängningen av patientens neutrofiler i avsaknad av en specifik antikropp.Använd rör nummer två, Sample-röret, för att mäta den oxidativa sprängningen som svar på LPS-antikroppskomplexet. Använd rör nummer tre, Max-röret, för att mäta maximal oxidativ explosion av patientens neutrofiler som svar på ett överskott av endotoxin. Använd rör nummer fyra, LPS-röret, som en källa till exogent endotoxin.Och använd tub nummer fem, Aliquot-röret, för blodförvaring. Samla in patientblodprover i sterila rör som innehåller EDTA-antikoaguleringsmedel, och förvara dem i rumstemperatur innan du kör EA-testet. Innan testet startas, sätt på chemiluminometern och inkubatorskakerna och värm inkubatorn till 37 grader Celsius.Placera först EA-rören som ska användas i rörställ, och ta bort locken. Använd en kamipipette för att överföra en milliliter av EA-reagensen från flaskan till rör nummer ett, nummer två, och nummer tre genom pipettering längs rörens sida. Försiktigt invertera blodinsamlingsröret 20 gånger för att blanda patientens blodprov.Sedan pipettera 0,5 milliliter patientblod i rör nummer fyra och rör nummer fem. Vortexrör nummer fyra i 10 sekunder. Placera tubställena med alla EA-provrören i inkubatorskaskören.Stäng locket, och inkubera i 37 grader Celsius i 10 minuter. Efter detta, öppna inkubatorlocket och ta bort rörställena från skakmaskinen. Vortex rör nummer fem.Med hjälp av en steril spets, pipettera 40 mikroliter blod i rör nummer ett och nummer två, i två exemplar. Vortex rör nummer fyra. Med samma pipettspets överför du 40 mikroliter blod från rör nummer fyra till rör nummer tre, i två exemplar.Vortexa de sex sista provrören en efter en. Placera röret rack tillbaka i inkubatorn shaker, och stäng locket. Ställ shaker till 100 rpm, och starta rörelsen i 14 minuter.Sätt in det EA-märkta chipkortet i chemiluminometern, och tryck på Start. Efter inkubationen på 14 minuter följer du instruktionerna som visas på chemiluminometern. Virvel försiktigt varje rör i 10 sekunder innan den placeras på provhållaren av chemiluminometern.Öppna provlådan och placera röret nummer ett i provhållaren. Stäng sedan provlådan och vänta på att den relativa ljusenheten avläsning. Upprepa denna läsprocess för rör två och tre och alla dubbletter, som skisseras i textprotokollet.Efter att alla rören har bearbetats kommer EA-resultaten att beräknas och skrivas ut automatiskt. Upprepa hela analysen processen för varje blodprov som måste testas. Förvara EA Assay kit och dess komponenter i den ursprungliga förseglade förpackningen vid en temperatur mellan två och 25 grader Celsius.I denna studie, en Endotoxin Activity Assay utförs för att upptäcka helblod endotoxemia i kritiskt sjuka patienter. Ett EA-värde på mindre än 0,40 EA-enheter indikerar en låg endotoxinaktivitetsnivå, lika med en låg cirkulerande LPS-koncentration, vilket utgör en låg risk för progression till ett allvarligt sjukdomstillstånd. Ett resultat mellan 0,40 och 0,59 EA-enheter indikerar en mellanliggande endotoxinaktivitetsnivå, vilket utgör en mellanrisk för utveckling av svår sepsis och septisk chock.Resultat som är lika med eller större än 0,60 EA-enheter indikerar en hög endotoxinaktivitetsnivå, vilket utgör en hög risk för septisk chock och dåliga patientresultat. Blod från rör nummer fyra och fem måste blandas med rätt provrör. Extra noga måste man se till att följa rätt ordning som anges i protokollet.Varje rör körs i dubbletter, potentiellt leder till misstag i denna fas. Efter dess införande har EA Assay föreslagits som en biomarkör för risk stratifiering av patient med systemisk hypoperfusion. Också, Det har studerats som ett screeningtest för att välja patienter för avancerad hemopurification behandlingsstrategier.

Research

JoVE Journal

Medicine

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Manuell muskel testning: en metod att mäta styrka Ytterligheter Muscle Tillämpat på kritiskt sjuka patienter

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Noggrann och enkel mätning av pro-inflammatoriska cytokin IL-1β med hjälp av en hel analys Blood stimulering

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

Sekvensering av bakteriell mikroflora i perifert blod: Vår erfarenhet av HIV-infekterade patienter

The healthy gastrointestinal tract is physiologically colonized by a large variety of commensal microbes that influence the development 
	of the humoral ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Snabb Point-of-Care analys av enoxaparin antikoagulantia Effekt i helblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Realtids cytotoxicitetsanalyser i humant helblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Network Analys av foramen ovale Elektrodrecordings i Läkemedelsresistenta Temporallobsepilepsi Patienter

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Hela genomet sekvensering av Candida glabrata för detektion av markörer av svampdödande läkemedelsresistens

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

How to Administer Near-Infrared Spectroscopy in Critically ill Neonates, Infants, and Children

Hur man administrerar nära infraröd spektroskopi i kritiskt sjuka nyfödda, spädbarn och barn

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated ...

Infrared Thermography for the Detection of Changes in Brown Adipose Tissue Activity

Infraröd termografi för detektion av förändringar i brun fettvävnadsaktivitet

Measuring brown adipose tissue (BAT) activity by positron emission tomography computed tomography (PET-CT) via the accumulation of 18F-fluorodeoxyglucose ...