Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها R مفتاح الوطنية & د البرنامج الصيني (2016YFA0500902)، الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (31471228, 31771653)، ومؤسسة العلوم جيانغسو "العلماء الشبان البارزين" (BK20150047)، العلوم الطبيعية مؤسسة من مقاطعة جيانغسو (BK20140897، 14KJA180005) والبرنامج المبتكرة والمشاريع الخاصة من مقاطعة جيانغسو إلى K.Z.

جميع التجارب على الحيوانات المؤداة أقرتها لجنة جامعة نانجينغ الطبية. وأبقى تحت ظروف كبيرة التي تسيطر عليها الفئران الذكور C57BL/6 وزودت بالغذاء والماء.
1-الأعمال التحضيرية
<ol><li>
Microinjection الشعيرات الدموية
	<ol>
<li>استخدام microinjection الشعيرات الدموية مع القطر الخارجي، ديميت...

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

يأخذ مكانة في ظهارة سيمينيفيروس الحيوانات المنوية وهو عملية مرتبة للغاية والدينامية التي تحكمها الخلايا الجرثومية وخلايا جسدية (مثلاً، خلايا سيرتولي)13. هيكل الفيرمونت، الذي يتكون من خلايا سيرتولي، يقسم ظهارة سيمينيفيروس القاعدية وحجرة قمي. تنمية الخلايا الجرثومي...

وتعتبر الثدييات الحيوانات المنوية عملية التنظيم تضم spermatogonial الذاتي تجديد والتمايز من خلال سبيرماتوسيتيس في المني فرداني عن طريق الانقسام، والانقسام، وسبيرميوجينيسيس، خلالها مثيرة تحدث التغييرات البيوكيميائية والمورفولوجية. يتم نقل الخلايا الجرثومية النامية تدريجيا من قاعدة أنبوب seminiferous نحو التجويف. وينظم هذه العملية خلية خلية الاتصالات بين الخلايا الجرثومية وخلايا سيرتولي1،2. تشكيل خلايا سيرتولي مجاورة BTB الذي يقع قرب القاعدة لأنبوب سيمينيفيروس. الفيرمونت جسديا يقسم الظهارة القاعدية وحجرة أدلومينال. خلال مراحل الثامن-التاسع دورة الظهارية، ترحيل سبيرماتوسيتيس بريليبتوتيني/leptotene من المقصورات القاعدية عبر الفيرمونت، دخول المقصورات أدلومينال3. ولذلك، وظيفة BTB توفير المكروية إيمونوبريفيليجيد لإنهاء الانقسام وسبيرميوجينيسيس4،،من56. خلافا للدم-الأنسجة حواجز أخرى (مثلاً، حاجز الدم في الدماغ) التي تتكون فقط من تقاطعات ضيق (TJs)، BTB شكلتها أربعة تقاطعات مختلفة (TJs التخصصات ectoplasmic وتقاطعات الفجوة، والمتوسطة المستندة إلى خيوط desmosomes) بين Sertoli الخلايا1،7.
واستخدمت العديد من الدراسات الفئران المعدلة وراثيا، وحالات العدوى بالفيروس، وسميات البيئية للتحقيق في آليات BTB السلامة7،،من89. تعطيل BTB يدفع ضعف الحيوانات المنوية والحيضيه أو العقم. منذ تشكيل BTB وسلامة تأكدت أن تتأثر الاتصالات بين خلايا سيرتولي8، نموذجا في المختبر استناداً إلى الثقافة الأولية من خلايا سيرتولي معزولة وقد استخدمت لدراسة الفيرمونت. ومع ذلك، لا يمكن دقة تقليد هذا النموذج BTB ديناميات فيفو. وعلاوة على ذلك، تم إنشاء لا ثقافة المشارك هذه الخلايا الجرثومية مع خلايا سيرتولي كما يمكن أن يعكس جميع المكونات الهيكلية والوظيفية ذات الصلة من10،BTB11.
وبصفة عامة، في فيفو BTB سلامة فحوصات عادة استناداً إلى جزيئات صغيرة، مثل وصلة لوبيس سولفو-دائرة الصحة الوطنية--LC-البيوتين ومترافق FITC inulin (الاينولين-فيتك). عادة، يتم حظر نشر البيوتين أو الاينولين-فيتك من حجرة القاعدية بهيكل الفيرمونت. ولذلك، نحن قادرون على استخدام هذا الأسلوب لتقييم مدى الضرر BTB مقارنة مع مجموعات المراقبة. بينما يمكن أن يثير الشبهة BTB مع أنواع معينة من المنبهات، مثل المعاملة مع (كدكل2) كلوريد الكادميوم12، يصبح BTB موجوداً للجزيئات الصغيرة، الذي أدخل حجرة أدلومينال في نهاية المطاف كمؤشرات.
أوائل في فيفو BTB سلامة مقايسة ينطوي على حقن البيوتين أو الاينولين-فيتك في حبل الوريد، الذي ينطوي على جراحة، والغازية، ومعقدة وتستغرق وقتاً طويلاً. إلى جانب ذلك، كالمواد مراسل منتشر عبر الجسم كله عن طريق الدورة الدموية، يقتصر تركيز المحلية البيوتين أو الاينولين-فيتك في الخصي. وعلاوة على ذلك، قد حمل التعرض للمنهجية ردود فعل المناعة. نقدم هنا، بسيطة وفعالة في فيفو BTB سلامة مقايسة تمكين الحقن المباشر قاسمة صغيرة من الاينولين فيتك في إينتيرستيتيوم للخصية. استخدام الفلورية وسم الأسلوب، عملية المصبوغة مريحة، كما الأجسام المضادة الثانوية غير مطلوبة. وهنا، هو تصور عملية صبغة الفلورسنت الدخول في الخصية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

الحيوانات المنوية هو تطوير spermatogonia إلى المني ناضجة في الخصي للخصية. ويدعم هذه العملية تقاطعات خلية سيرتولي على حاجز الدم-الخصية (الفيرمونت)، وهو أشد الحاجز الأنسجة في جسم الثدييات ويعزل ظهارة سيمينيفيروس في مقصورات اثنين، القاعدية وأدلومينال. BTB يخلق المكروية فريدة من نوعها للخلايا الجرثومية في الانقسام الاختزالي أنا/الثاني ومن أجل تطوير بوستميوتيك لوحظت في المني عن طريق سبيرميوجينيسيس. هنا، يمكننا وصف مقايسة موثوق بها رصد سلامة BTB الماوس الخصية في فيفو. BTB سليمة كتل نشر مترافق FITC الاينولين من القاعدية لحجرة قمي للخصي. هذا الأسلوب مناسبة لدراسة الجينات المرشحين أو الفيروسات أو السموم البيئية التي قد تؤثر على دالة BTB أو السلامة، مع إجراء سهل واشتراط الحد أدنى من المهارات الجراحية مقارنة بالأساليب البديلة.

الإعداد التجريبية لإجراء فحص سلامة BTB يرد في الشكل 1. سحب وشحذ microinjection الشعيرات الدموية مع ساحبة الشعرية وبيفيلير ميكروبيبيتي، على التوالي (الشكل 1A وج 1). سخان ترموستاتي ومعدات microinjection موضحة في الشكل 1 باء و دال...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم سلامة حاجز الدم-الخصية عن طريق حقن الاينولين-فيتك في الخصيتين. هذا هو أسلوب فعال في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية التي يمكن أن تتأثر بالعناصر الوراثية والبيئية.

أسلوب في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية الماوس

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حاجز الخصية الدموية في حقول البيولوجيا حول المرشحين للجينات أو الفيروسات أو السموم البيئية التي قد تؤثر على وظيفة حاجز الخصية أو السلامة. قبل ثلاثة أيام من الجراحة، علاج ما لا يقل عن ثلاثة ثمانية أسابيع من العمر C57Black/6 الفئران الذكور يوميا مع خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم الكادميوم كلوريد عن طريق الحقن داخل الصفتون. في يوم الجراحة، ضع نسيجًا نظيفًا على منطقة جراحية معقمة بنسبة 75٪ من الإيثانول، وحدد سخانًا حراريًا إلى 37 درجة مئوية.وضع الماوس تخدير على الأنسجة، ثم تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع. حلق شعر البطن مع ماكينة حلاقة، وتطهير الجلد المكشوف مع 75٪الإيثانول. إجراء شق جلدي سنتيمتر واحد فوق الغدد السابقة لفضح جدار البطن، واستخدام ملقط صغيرة لرفع الجلد لإجراء شق 0.5 سنتيمتر في الصفاق.استخدام ملقط للبحث عن منصات الدهون حول epididymis والخصية، وسحب بعناية منصات الدهون إلى فضح واحد الخصية المرفقة. ضع قطعة من الورق تسع سنتيمترات تحت منصات الدهون والخصية، وتحميل ماصات الحقن المجهري مع حل إينولين-FITC المعدة حديثا. قم بتوصيل الماصات بوحدة ميكرومانيبولاتور، واستخدم مجهرًا تشريحيًا لإدراج طرف ماصة الحقن الدقيق بلطف تحت tunica albuginea.تدوير ببطء ذراع التشغيل لتقديم 20 ميكرولترات من إينولين-FITC في الخلالي من الخصية. إذا كان التسليم ناجحا، سوف تتحول الخصية لون أخضر أصفر مشرق. على الفور إعادة الخصيات إلى تجويف البطن، وحقن الخصية contralateral مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، ثم إغلاق الجلد مع خياطة الجراحية.ووضع الماوس على وسادة الحرارة من سخان الحرارة. بعد 40 دقيقة من الحقن، استخدم مقصًا حادًا لجمع الخصيتين من كل فأر، وغسل الأنسجة في ملليلتر واحد من PBS البارد من الجليد. بعد ذلك، قم بإصلاح الخصيات في 4٪ من الـ paraformaldehyde عند أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة متبوعة بثلاثة غسلات في 1.5 ملليلتر من 1٪ PBS لكل غسل.بعد 30٪ الجفاف السكروز بين عشية وضحاها، ونقل العينات في إطارات التضمين الفردية، وتغطي الأنسجة مع مجمع درجة حرارة القطع الأمثل. تعيين درجة حرارة التبريد إلى درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية ووضع الإطارات في التبريد لمدة 10 دقائق حتى يتم تجميد أكتوبر. ثم، ملء كل إطار تضمين مع أكتوبر الطازجة حتى يتم تغطية الخصية كلها في كل قالب.عندما تكون الطبقة الثانية من أكتوبر قد جمدت، والحصول على خمسة ميكرومتر سميكة أقسام عرضية من كل الخصية، والتقاط أقسام الأنسجة على الشرائح المجهر الزجاجي كما يتم الحصول عليها. لتصوير العينات، اسخِن الشرائح أولاً في صندوق مرطب في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق، اغسل الشرائح ثلاث مرات بالملاحي الطازجة المخزنة في تريس في كل غسل، واسمح للقطع بالجفاف لمدة خمس دقائق محمية من الضوء.استخدام ورق خال من الغبار لإزالة أي المالحة المتبقية، وتركيب العينات مع DAPI الملحقة المتوسطة تصاعد. ثم، تغطية كل عينة مع زلة غطاء مقلوب، وصورة العينات تحت الهدف 20X من المجهر confocal. ثلاثة أيام من العلاج كلوريد الكادميوم يسبب ضررا لحواجز الخصية الدموية مما يسمح inulin-FITC انتشار من المقصورة القاعدية إلى المقصورة apical من ظهارة شبهية.في المقابل، يتم حظر هذا الانتشار في الخصيات التحكم PBS المعالجة. يتم تحديد مدى الضرر حاجز الخصية الدموية عن طريق حساب نسبة من المسافة من انتشار إينولين -FITC إلى نصف قطر الأنبوب شبهي نفسه. وعلاوة على ذلك، فإن حاجز ال testis الدم سليمة في heterozygous Rictor floxed فئران خروج المغلوب كتل انتشار inulin عبر الحاجز في المقصورة apical، في حين أن الفئران خروج المغلوب ريكتور مشروط تمتلك حاجز الخصية الدم للخطر الذي يسمح نشر إينولين.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أن نقدم inulin-FITC المعدة في يوم التجربة والحفاظ على الأنسجة المحمية من الضوء منذ FITC هو جزيء حساس للضوء. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج ضعف تكوين الحيوانات المنوية لأن وظيفة حاجز الخصية الدموية هي توفير بيئة صغيرة متميزة مناعية لإكمال اليونيسيس في تكوين الحيوانات المنوية. بعد تطورها ، توفر هذه التقنية طريقة للباحثين في مجال الطب التناسلي لاستكشاف العقم والعقم في الفئران.لا تنس أن العمل مع الـ ما قبلات الـمادهياد يمكن أن يكون خطيراً للغاية وأن الاحتياطات مثل ارتداء الملابس وأقنعة الوجه يجب أن تتخذ دائمًا عند إجراء هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

باستخدام<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الثقافات تستقيم القطرة من الجامعة الجنين هيئات لدراسة العمليات التنموية خلال الماوس توالد

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

وسيلة فعالة للحصول على خلايا Dedifferentiated الدهون

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

في المختبر وفي النماذج الحية لدراسة الانتقال القرنية غشائي-الوسيطة

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; طريقة التصوير الوقت الفاصل بين الجرذ شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مساريقي مثقف

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

نموذج الماوس هايبراندروجينيك لدراسة متلازمة تكيس المبيض

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...