Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den nationale nøgle R & D Program i Kina (2016YFA0500902), National Natural Science Foundation of China (31471228, 31771653), Jiangsu Science Foundation for fremtrædende unge akademikere (BK20150047), naturvidenskabelige Grundlæggelsen af Jiangsu provinsen (BK20140897, 14KJA180005) og den innovations- og iværksætterevner Program af Jiangsu-provinsen til K.Z.

Alle udført dyreforsøg er blevet godkendt af udvalgets Nanjing medicinske universitet. Mandlige C57BL/6 mus blev holdt under kontrollerede lysperiode betingelser og blev leveret med mad og vand.
1. præparater
<ol><li>
Mikroinjektion kapillærer
	<ol>
<li>Bruge mikroinjektion kapillærer med en ydre diameter, indre dimeter og 1,0 mm, 0,8 mm og 10,0 cm, længde henholdsvis.</li>
		<li>Trække glas kapillærer med en kapillær puller (figur 1A)....

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

Spermatogenesen foregår i seminiferous epitel og er en yderst bestilte og dynamisk proces, der styres af kønsceller og somatiske celler (f.eks. Sertoli celler)13. BTB-struktur, der er fremstillet af Sertolicellerne, opdeler seminiferous epitel i en basal og en apikale rum. Udviklingen af meiotiske og haploide kønsceller opstår i den apikale rum, som danner en immunologisk barriere14.
Funktionen BTB kan blive kompromitteret a...

Pattedyr spermatogenesen betragtes som en meget struktureret proces, som omfatter spermatogonial selvfornyelse og differentiering gennem spermatocytes i haploide sædceller via mitose og meiose spermiogenesis, hvorunder dramatiske biokemiske og morfologiske ændringer sker. Udvikle kønsceller transporteres gradvis fra bunden af den seminiferous tubulus mod lumen. Denne proces er reguleret af celle-celle kontakter mellem kimceller og Sertoli celler1,2. Tilstødende Sertoli celler danner den BTB, der ligger i nærheden af bunden af de seminiferous tubuli. I BTB opdeler fysisk epitel i en basal og et adluminal rum. Gennemførelsesstadier VIII - IX af epitel cyklus, overføre preleptotene/leptotene spermatocytes fra de basale rum på tværs af BTB, ind i adluminal rum3. Derfor, BTB funktion er at give en immunoprivileged mikromiljø for færdiggørelsen af meiose og spermiogenesis4,5,6. I modsætning til andre blod-væv barrierer (f.eks, blod - hjerne barrieren), der kun består af stram vejkryds (TJs), er BTB dannet af fire forskellige vejkryds (TJs ektoplasmiske specialer, gap vejkryds og mellemliggende glødetråd-baseret desmosomes) mellem Sertoli celler1,7.
Mange undersøgelser har brugt genmodificerede mus, virusinfektioner og miljømæssige giftstoffer til at undersøge mekanismerne for BTB integritet7,8,9. BTB forstyrrelser inducerer nedsat spermatogenese og subfertilitet eller infertilitet. Da BTB dannelse og integritet er blevet bekræftet at være påvirket af kontakter mellem Sertoli celler8, en in vitro- model baseret på primær kultur af isolerede Sertoli celler har været anvendt til BTB undersøgelse. Denne model kan ikke nøjagtigt efterligne BTB dynamics in vivo. Derudover er ingen sådan fælles kultur af kønsceller med Sertoli celler blevet oprettet som at afspejle alle relevante strukturelle og funktionelle komponenter af BTB10,11.
I almindelighed, er i vivo BTB integritet assays typisk baseret på små molekyler, såsom EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin og FITC-konjugeret inulinsirup (inulin-FITC). Normalt, er diffusion af biotin eller inulin-FITC fra de basale rum blokeret af BTB struktur. Derfor, vi er i stand til at bruge denne metode til at vurdere omfanget af BTB skade sammenlignet med kontrolgruppen. Mens BTB kan blive kompromitteret med visse typer af stimuli, såsom behandling med cadmium chlorid (CdCl2)12, bliver BTB tilgængelige for små molekyler, som i sidste ende kommer ind i adluminal rum som indikatorer.
En tidlig i vivo BTB integritet analyse indebærer injektion af biotin eller inulin-FITC i halsfedt, som indebærer kirurgi, og er invasiv, kompliceret og tidskrævende. Desuden som reporter stoffer diffuse gennem hele kroppen via omsætning, er den lokale koncentration af biotin eller inulin-FITC i seminiferous tubules begrænset. Derudover kan systemisk eksponering fremkalde immun reaktioner. Her præsenterer vi en enkel og effektiv i vivo BTB integritet assay muliggør direkte injektion af en lille alikvot af inulin-FITC i interstitium af en testis. Brug af fluorescerende mærkning metode, er farvning processen praktisk, som sekundære antistoffer ikke er påkrævet. Her er processen med fluorescerende farvestof indtastning testiklerne visualiseret.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

Spermatogenesen er udvikling af spermatogonia til modne sædceller i testiklerne seminiferous tubules. Denne proces understøttes af Sertoli celler vejkryds på blod-testis barriere (BTB), som er den strammeste væv barriere i selve pattedyr og udskiller seminiferous epitel i to rum, en basal og en adluminal. I BTB skaber en unik mikromiljø for kønsceller i meiose jeg / II og til udvikling af postmeiotiske spermatider til sædceller via spermiogenesis. Her, beskriver vi en pålidelig analyse til at overvåge BTB integritet af musen testiklerne i vivo. En intakt BTB blokerer diffusion af FITC-konjugeret inulin fra de basale til den apikale rum af de seminiferous tubules. Denne teknik egner sig til at studere gen kandidater, vira eller miljømæssige giftstoffer, der kan påvirke BTB funktion eller integritet, med en let procedure og en minimal krav på kirurgiske færdigheder i forhold til alternative metoder.

Den eksperimentelle set-up til at udføre BTB integritet assay er vist i figur 1. Trække og skærpe mikroinjektion kapillærer med en kapillær aftrækker og mikropipette beveler, henholdsvis (figur 1A og 1 C). Termostatisk varmelegeme og udstyr til mikroinjektion er illustreret i figur 1B og 1 D.
<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere blod-testis barriere integritet ved at indsprøjte inulin-FITC i testiklerne. Dette er en effektiv i vivo metode til at studere blod-testis barriere integritet, der kan være kompromitteret af genetiske og miljømæssige elementer.

En In Vivo -metode til at studere mus blod-Testis barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i blod-testis barriere af biologi felter om gen kandidater, vira, eller miljømæssige toksiner, der kan påvirke blod-testis barriere funktion eller integritet. Tre dage før operationen behandles mindst tre otte uger gamle C57Black/6 hanmus dagligt med fem milligram pr. kg cadmiumchlorid via intraperitoneal injektion. På dagen for operationen, placere et rent væv over en 75% ethanol-steriliseret kirurgisk område og indstille en termostatvarmer til 37 grader Celsius.Placer en bedøvet mus på vævet, derefter bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids. Barber mavehåret med en barbermaskine, og desinficere den eksponerede hud med 75% ethanol. Lav en en-centimeter hud snit over præputialtrene til at udsætte bugvæggen, og bruge små kraftbefædre til at løfte huden for at gøre en 0,5-centimeter snit i bughinden.Brug de vicess til at søge efter fedt puder omkring epididymis og testikler, omhyggeligt trække fedt puder ud for at udsætte en vedhæftet testis. Placer en ni-centimeter stykke papir under fedt puder og testikler, og læg en mikroinjection pipette med frisklavet inulin-FITC opløsning. Tilslut pipetten til en mikromanipulatorenhed, og brug et dissekerende mikroskop til forsigtigt at indsætte mikroinjektionspipettespidsen under tunica albuginea.Drej langsomt driftsgrebet for at levere 20 mikroliter af inulin-FITC ind i testiklenes interstitium. Hvis leveringen lykkes, vil testis vende en lys grøn-gul farve. Straks returnere testikerne til bughulen, og injicere de kontralaterale testikler med 20 mikroliter af PBS, derefter lukke huden med en kirurgisk sutur.Og læg musen på varmepuden på en termostatvarmer. 40 minutter efter injektionen skal du bruge en skarp saks til at indsamle testiklerne fra hver mus og vaske vævet i en milliliter iskold PBS. Dernæst fastgør testiklerne i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius i 12 til 24 timer efterfulgt af tre vaske i 1,5 milliliter 1% PBS per vask.Efter 30% saccharose dehydrering natten over, overføre prøverne i individuelle indlejring rammer, og dække væv med optimal skæretemperatur sammensatte. Indstil temperaturen af en kryostat til negative 20 grader Celsius og læg rammerne i kryostaten i ca. 10 minutter, indtil OLT er frosset. Derefter fylde hver indlejring ramme med frisk OKT, indtil hele testikerne er dækket i hver støbeform.Når det andet lag AF OLT er frosset, erhverve en fem-mikrometer-tykke tværsnit af hver testis, fange væv sektioner på glas mikroskop dias, som de er opnået. For at afbilde prøverne skal du først varme objektglassene i en befugtet kasse ved stuetemperatur. Efter 10 minutter vaskes objektglassene tre gange i frisk Tris-bufferet saltvand pr. vask, og sektionerne tørres i fem minutter beskyttet mod lys.Brug støvfrit papir til at fjerne eventuelt restsyle, og monter prøverne med DAPI-suppleret monteringsmedium. Derefter dække hver prøve med en omvendt dække slip, og billede prøverne under 20X målet om en konfokal mikroskop. Tre dages behandling af cadmiumchlorid forårsager skade på blodtestisbarrieren, der gør det muligt at sprede inulin-FITC-diffusion fra det basale rum til det apikale rum i det seminiferøse epitel.I modsætning hertil er denne diffusion blokeret i kontrol PBS-behandlede testikler. Omfanget af beskadigelsen af blodtestisbarrieren bestemmes ved at beregne forholdet mellem afstanden mellem inulin-FITC-diffusionen og radius af samme seminiferøse tubule. Yderligere, den intakte blod-testis barriere i heterozygot Rictor floxed knockout mus blokerer inulin diffusion over barrieren i det apikale rum, mens betingede Rictor knockout mus besidder en kompromitteret blod-testis barriere, der tillader inulin diffusion.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at levere inulin-FITC forberedt på dagen for forsøget og at holde vævet beskyttet mod lys, da FITC er et lysfølsomt molekyle. Konsekvenserne af denne teknik omfatter behandling af nedsat spermatogenese, fordi funktionen af blod-testis barriere er at give en immun-privilegeret mikromiljø til færdiggørelse af meiose i spermatogenese. Efter dens udvikling, denne teknik giver en måde for forskere inden for reproduktiv medicin til at udforske subfertilitet og infertilitet i mus.Glem ikke, at arbejde med paraformaldehyderne kan være yderst farligt, og at forholdsregler såsom iført tøj og ansigtsmasker bør altid tages, når du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Brug<em&gt; Ex vivo</em&gt; Upright dråbedistribution Kulturer af Whole Fetal organer til at studere udviklingsprocesser under Mus Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcelle-lignende<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Eksplantater at studere Tidlig Neural Udviklingsmæssige Egenskaber<em&gt; In vitro</em&gt; Og<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metode til at opnå dedifferentierede fedtceller

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro og in vivo modeller til at studere hornhindeendothel-mesenkymale Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metode til Time-Lapse Imaging af dyrkede Rat Mesenteriske Mikrovaskulære Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering af larve zebrafisk som en dyr Model til at undersøge Trypanosoma cruzi motilitet In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

En Hyperandrogenic musen Model til at studere polycystisk ovariesyndrom

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...