Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale toets R & D programma van China (2016YFA0500902), de nationale Natural Science Foundation van China (31471228, 31771653), de Jiangsu Science Foundation voor DN jonge geleerden (BK20150047), de natuurwetenschappen Stichting van de provincie Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) en het innovatieve en ondernemende programma van de oostelijke provincie Jiangsu te K.Z.

Alle uitgevoerde dierproeven zijn goedgekeurd door het Comité van de Nanjing Medizinische Universität. Mannelijke C57BL/6 muizen werden gehouden onder omstandigheden van de gecontroleerde fotoperiode en werden bevoorraad met voedsel en water.
1. voorbereiding
<ol><li>
Microinjection haarvaten
	<ol>
<li>Gebruik van microinjection haarvaten met een buitendiameter, innerlijke dimeter en lengte van 1,0 mm, 0,8 mm en 10,0 cm, respectievelijk.</li>
		<li>Trek glas haarvaten met ...

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

Spermatogenese vindt plaats in de seminiferous epitheel en is een zeer geordende en dynamisch proces, dat wordt beheerst door kiemcellen en somatische cellen (bijvoorbeeld, Sertoli cellen)13. De BTB-structuur, die is gebouwd door de Sertoli-cellen, verdeelt de seminiferous epitheel in een basale en een apicaal compartiment. De ontwikkeling van Meiotische en haploïde geslachtscellen treedt op in de apicale compartiment dat een immunologische barrière14 vormt</s...

Zoogdieren spermatogenese wordt beschouwd als een zeer gestructureerde proces dat spermatogonia zelf-vernieuwing en differentiatie via spermatocyten in de haploïde spermacellen via mitose, meiose, en spermiogenesis, gedurende welke dramatische omvat biochemische en morfologische veranderingen optreden. Ontwikkelende geslachtscellen worden geleidelijk vervoerd vanaf de basis van de seminiferous zaadvormende richting de lumen. Dit proces wordt gereguleerd door cel contacten tussen kiemcellen en Sertoli cellen1,2. Aangrenzende Sertoli cellen vormen de BTB die zich in de buurt van de basis van de seminiferous zaadvormende bevindt. De BTB verdeelt fysiek het epithelium in een basale en een adluminal-compartiment. Tijdens fase VIII - IX van de epitheliale cyclus, migreren preleptotene/leptotene spermatocyten van de basale compartimenten over het BTB, de adluminal compartimenten3invoeren. Daarom wil de functie van het BTB bieden een immunoprivileged communicatie voor de voltooiing van de meiose en spermiogenesis4,5,6. In tegenstelling tot andere bloed-weefsel-barrières die (b.v., bloed - hersenbarrière) en dat alleen uit strakke kruispunten (TJs bestaat), wordt de BTB gevormd door vier verschillende kruispunten (TJs, ectoplasmic specialisaties kloof kruispunten en intermediair gloeidraad gebaseerde desmosomes) tussen Sertoli cellen1,7.
Vele studies hebben gebruikt genetisch gemodificeerde muizen, virusinfecties en toxische stoffen in het milieu te onderzoeken van de mechanismen van BTB integriteit7,8,9. De verstoring van de BTB induceert verminderde spermatogenese en subfertility of onvruchtbaarheid. Aangezien de BTB vorming en integriteit zijn bevestigd te worden beïnvloed door contacten tussen Sertoli cellen8, een in vitro model gebaseerd op de primaire cultuur van geïsoleerde Sertoli cellen is gebruikt voor BTB studie. Echter dit model kan niet nauwkeurig na te bootsen BTB dynamiek in vivo. Bovendien is geen dergelijke co cultuur van kiemcellen met Sertoli cellen opgezet als staat als gevolg van alle relevante structurele en functionele onderdelen van het BTB10,11.
In het algemeen, zijn in vivo de tests van de integriteit van het BTB meestal gebaseerd op kleine molecules, zoals EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine en FITC-geconjugeerd inuline (inuline-FITC). Normaal gesproken, wordt de verspreiding van biotine of inuline-FITC van de basale compartiment geblokkeerd door BTB structuur. Daarom kunnen wij deze methode gebruiken om te beoordelen in welke mate van BTB schade in vergelijking met controlegroepen. Terwijl BTB kan worden aangetast met bepaalde soorten stimuli, zoals behandeling met cadmium chloride (CdCl2)12, wordt BTB toegankelijk voor kleine molecules, die uiteindelijk het compartiment van de adluminal als indicatoren invoeren.
Een vroege in vivo BTB integriteit bepaling houdt injecteren van biotine of inuline-FITC in de halsslagader, die houdt van chirurgie, en invasieve, ingewikkeld en tijdrovend. Bovendien, als de verslaggever stoffen door het hele lichaam via het verkeer verspreiden, de plaatselijke concentratie van biotine of inuline-FITC in de seminiferous buisjes is beperkt. Systemische blootstelling kan bovendien immuunreacties veroorzaken. Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve in-vivo BTB integriteit assay directe injectie van een kleine hoeveelheid van de inuline-FITC in het interstitium van een testis inschakelen. Met behulp van de TL labeling methode, is de kleuring proces handig, als secundaire antilichamen niet vereist zijn. Hier is het proces van fluorescente kleurstof invoeren van de testis gevisualiseerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

Spermatogenese is de ontwikkeling van de testis tot volwassen spermacellen in de seminiferous tubuli van de testis. Dit proces wordt ondersteund door de Sertoli cell kruispunten op de bloed-testis barrière (BTB), die is de strakste barrière van het weefsel in het lichaam van zoogdieren en beveiligingsmethode de seminiferous epitheel in twee compartimenten, een basale en een adluminal. De BTB creëert een unieke communicatie voor kiemcellen in meiose I / II en voor de ontwikkeling van postmeiotic spermatids in spermacellen via spermiogenesis. Hier beschrijven we een betrouwbare test om te controleren van de integriteit van het BTB van muis testis in vivo. Een intact BTB blokkeert de verspreiding van FITC-geconjugeerd inuline uit de basale tot het apicale compartiment van de seminiferous buisjes. Deze techniek is geschikt voor de studie van gene kandidaten, virussen of milieu toxische stoffen die BTB functionaliteit of integriteit, met een eenvoudige procedure en een minimale vereiste voor chirurgische vaardigheden in vergelijking met alternatieve methoden kunnen beïnvloeden.

De experimentele opstelling voor het uitvoeren van de bepaling van BTB integriteit is afgebeeld in Figuur 1. Trek en verscherpen microinjection haarvaten met een capillaire trekker en micropipet beveler, respectievelijk (figuur 1A en 1 C). De thermostaat van de kachel en de apparatuur van microinjection worden geïllustreerd in figuur 1B en 1 D.
<p class="jove_co...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de bloed-testis barrière integriteit door het injecteren van inuline-FITC in teelballen. Dit is een efficiënte in-vivo -methode om te studeren bloed-testis barrière integriteit die kan worden aangetast door genetische en omgevingsfactoren elementen.

Een In Vivo methode om te studeren muis bloed-Testis barrière integriteit

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de bloed-testis barrière van biologie velden over gen kandidaten, virussen, of milieu-toxines die van invloed kunnen zijn bloed-testis barrière functie of integriteit. Behandel drie dagen voor de operatie dagelijks ten minste drie acht weken oude C57Black/6 mannelijke muizen met een vijf milligram per kilogram lichaamsgewicht cadmiumchloride via intraperitoneale injectie. Op de dag van de operatie, plaats een schoon weefsel over een 75%ethanol gesteriliseerd chirurgisch gebied en stel een thermostatische kachel op 37 graden Celsius.Plaats een verdoofde muis op het weefsel en bevestig vervolgens een gebrek aan respons op teenknijpen. Scheer het buikhaar met een scheerapparaat en desinfecteer de blootgestelde huid met 75% ethanol. Maak een huidincisie van één centimeter boven de preputiale klieren om de buikwand bloot te stellen en gebruik kleine tangen om de huid op te tillen om een incisie van 0,5 centimeter in het buikvlies te maken.Gebruik de tangen om te zoeken naar vet pads rond de epididymis en testis, zorgvuldig trekken van de vetpads uit om een bijgevoegde testis bloot. Plaats een stuk papier van negen centimeter onder de vetpads en testis en laad een microinjectiepipet met vers bereide inuline-FITC-oplossing. Sluit de pipet aan op een micromanipulator-eenheid en gebruik een ontledende microscoop om de microinjectiepipetpunt voorzichtig onder de tunica albuginea te plaatsen.Draai de bedieningshendel langzaam om 20 microliter van de inuline-FITC in het interstitium van de testis te leveren. Als de levering succesvol is, zal de testis een felgroen-gele kleur. Breng de testis onmiddellijk terug naar de buikholte en injecteer de contralaterale testis met 20 microliter PBS en sluit de huid vervolgens met een chirurgische hechting.En plaats de muis op het verwarmingskussen van een thermostatische kachel. 40 minuten na de injectie, gebruik een scherpe schaar om de teelballen van elke muis te verzamelen en was de weefsels in een milliliter ijskoude PBS. Bevestig vervolgens de teelballen in 4%paraformaldehyde bij vier graden Celsius gedurende 12 tot 24 uur, gevolgd door drie wasbeurten in 1,5 milliliter van 1%PBS per wasbeurt.Na 30% sacharose uitdroging 's nachts, breng de monsters in individuele inbedding frames, en bedek de weefsels met een optimale snijtemperatuur verbinding. Stel de temperatuur van een cryostat in op negatieve 20 graden Celsius en plaats de frames ongeveer 10 minuten in de cryostat totdat de OKT is bevroren. Vul vervolgens elk inbeddingsframe met verse OCT totdat de hele testis in elke mal is bedekt.Wanneer de tweede laag OKT is bevroren, verwerven van een vijf-micrometer-dikke dwarsdoorsnedes van elke testis, het vastleggen van de weefselsecties op glazen microscoop dia's als ze worden verkregen. Als u de monsters wilt verbeelden, verwarmt u eerst de dia's in een bevochtigde doos bij kamertemperatuur. Na 10 minuten was je de glijbanen drie keer in verse Tris-gebufferde zoutoplossing per wasbeurt en laat je de secties vijf minuten drogen, beschermd tegen licht.Gebruik stofvrij papier om eventuele resterende zoutoplossing te verwijderen en monteer de monsters met dapi-supplementedrerend montagemedium. Bedek vervolgens elk monster met een omgekeerde cover slip, en beeld de monsters onder de 20X doelstelling van een confocale microscoop. Drie dagen cadmiumchloridebehandeling veroorzaakt schade aan de bloedtestisbarrière waardoor inuline-FITC diffusie van het basale compartiment naar het apicale compartiment van het halfniferous epitheel mogelijk wordt.Deze diffusie wordt daarentegen geblokkeerd in besturing met PBS-behandelde teelballen. De omvang van de schade aan de bloedtestenbarrière wordt bepaald door de verhouding van de afstand van de inuline-FITC diffusie tot de straal van dezelfde halfniferous tubuli te berekenen. Verder, de intacte bloed-testis barrière in heterozygoot Rictor floxed knock-out muizen blokken inuline diffusie over de barrière in de apical compartiment, terwijl de voorwaardelijke Rictor knock-out muizen beschikken over een gecompromitteerde bloed-testis barrière die het mogelijk maakt inuline diffusie.Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om inuline-FITC bereid op de dag van het experiment te leveren en om het weefsel beschermd tegen licht te houden, omdat FITC een lichtgevoelig molecuul is. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de therapie van verminderde spermatogenese omdat de functie van de bloedtestisbarrière is om een immuun-bevoorrechte micro-omgeving te bieden voor de voltooiing van meiose in spermatogenese. Na zijn ontwikkeling, verstrekt deze techniek een manier voor onderzoekers op het gebied van reproductieve geneeskunde om subvruchtbaarheid en onvruchtbaarheid in muizen te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyden zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van kleding en gezichtsmaskers altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Een muismodel van Hyperandrogenic te bestuderen polycysteus ovarium syndroom

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...