Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

עבודה זו נתמך על ידי ה-R המפתח הלאומית & D התוכנית של סין (2016YFA0500902), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31471228, 31771653), קרן המדע ג'יאנגסו עבור חוקרים צעירים מכובד (BK20150047), מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20140897, 14KJA180005), התוכנית יזמיים וחדשניים של מחוז ג'יאנגסו אל K.Z.

כל הניסויים שבוצעו אושרו על ידי ועדת נאנג'ינג הרפואי האוניברסיטאי. זכר C57BL/6 הוחזקו בתנאים מבוקרים photoperiod ועכברים סופקו עם מים ואוכל.
1. תכשירים
<ol><li>
נימים microinjection
	<ol>
<li>השתמש microinjection נימים עם הקוטר החיצוני, dimeter הפנימית, אורך של 1.0 מ מ, מ מ 0.8 ס מ 10.0, בהתאמה.</li>
		<li>משוך נ...

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

יצירת זרע לוקח מקום האפיתל וכמה, הוא תהליך מאוד מסודר ודינמי נשלטת על ידי בתאי הנבט ותאים סומטיים (למשל, התאים Sertoli)13. המבנה BTB, אשר נבנה על ידי תאי סרטולי, מחלק וכמה האפיתל של הבסיס, תא של הפסגה. הפיתוח של meiotic, הפלואידי בתאי הנבט מתרחשת בתוך התא הפסגה המהווה מכשול אימונו...

בתרבית של יצירת זרע נחשב תהליך מובנה מאוד שמקיף התחדשות עצמית spermatogonial ובידול דרך spermatocytes לתוך spermatozoa הפלואידי באמצעות מיטוזה, מיוזה, spermiogenesis, שבמהלכו דרמטי שינויים ביוכימיים, מורפולוגיים להתרחש. מתפתחות בתאי הנבט מועברים בהדרגה מבסיס של צנורית וכמה לכיוון לומן. תהליך זה מוסדר על ידי תאים תאים הקשר בין בתאי הנבט סרטולי תאים1,2. התאים Sertoli הסמוכים טופס BTB הממוקמת ליד בסיס צנורית וכמה. BTB מחלק פיזית האפיתל של הבסיס, תא של adluminal. בשלבים השמיני - התשיעי של מחזור אפיתל, preleptotene/leptotene spermatocytes מן התאים הבזליים לנדוד בין BTB, להזין את התאים adluminal3. לכן, תפקוד BTB נועד לספק של microenvironment immunoprivileged להשלמת מיוזה, spermiogenesis4,5,6. בניגוד רקמות דם מכשולים אחרים (למשל, מחסום הדם - מוח) רק המורכבות צמתי צר (TJs), BTB נוצרת על ידי ארבעה צמתים שונים (TJs מתמחה רוחות, הפער צמתי, ביניים מבוסס-פילמנט desmosomes) בין סרטולי תאים1,7.
מחקרים רבים השתמשו מהונדס גנטית עכברים הידבקות בווירוסים, חשיפה לרעלים סביבתיים כדי לחקור מנגנונים של BTB שלמות7,8,9. השיבוש BTB מעוררת יצירת זרע לקוי ולא subfertility או אי פוריות. מאז היווצרות BTB ותקינות אושרו להיות מושפעות מגעים בין תאי סרטולי8, במבחנה מודל המבוסס על תרבות העיקרי של תאי סרטולי מבודד שימש למחקר BTB. עם זאת, מודל זה במדויק לא יכול לחקות BTB dynamics vivo בתוך. יתר על כן, אין תרבות משותפת כזו תאי נבט עם תאי סרטולי נוצרה כמו מסוגל המשקף את כל הרכיבים פונקציונלי מבניים הרלוונטיים של ה BTB10,11.
באופן כללי, אין ויוו מבחני יושרה BTB מבוססים בדרך כלל על מולקולות קטנות, כגון EZ-קישור Sulfo-NHS-LC-ביוטין, אינולין FITC מצומדת (אינולין-FITC). בדרך כלל, פעפוע של ביוטין או אינולין-FITC מן התא הבסיס חסומה על-ידי BTB מבנה. לכן, אנו מסוגלים להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את היקף הנזק BTB לעומת קבוצות שליטה. בעוד BTB יכול להיות בסכנה עם סוגים מסוימים של גירויים, כגון טיפול עם קדמיום כלוריד (CdCl2)12, BTB הופך נגיש מולקולות קטנות, אשר בסופו של דבר הזן תא adluminal מחוונים.
מוקדם ויוו BTB שלמות assay המוחלשים ביוטין או אינולין-FITC לתוך ומוחלף על, אשר כרוך הניתוח, היא פולשנית, מסובך, גוזלת זמן. חוץ מזה, כל החומרים כתב מפוזרת באמצעות הגוף כולו דרך מחזור הדם, הריכוז המקומי של ביוטין או אינולין-FITC ב בקוריאנית וכמה הוא מוגבל. יתר על כן, חשיפה מערכתית עלול לגרום לתגובות החיסון. כאן, אנו מציגים פשוטה ויעילה ויוו BTB שלמות assay הפעלת הזרקה ישירה של aliquot קטן של אינולין-FITC לתוך interstitium של מבחן. שימוש של פלורסנט שיטת תיוג, התהליך מכתימים הוא נוח, כמו נוגדנים משניים אינם נדרשים. כאן, התהליך של הפלורסנט הזנת בזרמה הוא מדמיין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

יצירת זרע הוא הפיתוח של spermatogonia לתוך spermatozoa בוגרת ב בקוריאנית וכמה של בזרמה. תהליך זה נתמך על ידי צמתי תא סרטולי-מחסום דם-testis (BTB), אשר היא המכשול הכי צפופה רקמות בגוף יונקים segregates האפיתל וכמה לתוך שני תאים, על הבסיס של adluminal. BTB יוצרת microenvironment ייחודי בתאי הנבט, מיוזה אני / II ועל ההתפתחות של postmeiotic spermatids לתוך spermatozoa דרך spermiogenesis. כאן, אנו מתארים וזמינותו אמין כדי לפקח BTB שלמות של העכבר testis ויוו. BTB שלם חוסם פעפוע של FITC מצומדת אינולין מן הבסיס כדי תא הפסגה של בקוריאנית וכמה. טכניקה זו מתאימה ללמוד מועמדים הגן, וירוסים או חשיפה לרעלים סביבתיים שעשויים להשפיע על תפקוד BTB או תקינות, עם הליך קל, דרישה מינימלית של היכולות הכירורגיים לעומת שיטות אלטרנטיביות.

הסידור ניסיוני עבור ביצוע וזמינותו שלמות BTB מוצג באיור1. משוך, חידוד נימים microinjection עם נימי פולר, micropipette beveler, בהתאמה (איור 1A וג 1). ברים, מערכות אינסטלציה חימום וציוד microinjection מומחשים איור 1B ו- 1 D.
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את תקינות מחסום דם-testis על ידי הזרקת אינולין-FITC לתוך האשכים. זוהי שיטה יעילה ויוו ללמוד שלמות מחסום דם testis. זה יכול להיות בסכנה על ידי אלמנטים גנטיים וסביבתיים.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחסום בדיקת הדם של תחומי הביולוגיה על מועמדים לגנים, וירוסים או רעלנים סביבתיים שעלולים להשפיע על תפקוד מחסום בדיקת הדם או על שלמותו. שלושה ימים לפני הניתוח, לטפל לפחות שמונה שבועות C57Black/6 עכברים זכרים מדי יום עם חמישה מיליגרם לכל קילוגרם משקל הגוף קדמיום כלוריד באמצעות הזרקה תוך-ניתוחית. ביום הניתוח, מניחים רקמה נקייה מעל אזור כירורגי מעוקר 75% אתנול ולהגדיר תנור תרמוסטטי ל 37 מעלות צלזיוס.מניחים עכבר הרדמה על הרקמה, ולאחר מכן לאשר חוסר תגובה לצביטת בוהן. מגלחים את שיער הבטן עם מכונת גילוח, ומחטאים את העור החשוף עם 75% אתנול. בצע חתך בעור בסנטימטר אחד מעל בלוטות הקדם-ליחה כדי לחשוף את דופן הבטן, ולהשתמש בממטרים קטנים כדי להרים את העור כדי לבצע חתך של 0.5 ס"מ בצלע.השתמש במטחנים כדי לחפש רפידות שומן סביב epididymis ו testis, בזהירות מושך את רפידות השומן החוצה כדי לחשוף אשך אחד מצורף. מניחים פיסת נייר באורך תשעה סנטימטרים מתחת לכריות השומן והאסטיס, ומעמיסים פיפטה מיקרו-ג'ינג'י עם תמיסת אינולין-FITC שהוכנה זה עכשיו. חבר את הפיפלט ליחידת מיקרומניפולטור, ולהשתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי להכניס בעדינות את קצה פיפטה microinjection מתחת אלביניה טוניקה.סובב באיטיות את ידית ההפעלה כדי לספק 20 מיקרוליטרים של inulin-FITC לתוך האינטרסטיטיום של האשכים. אם המסירה תצליח, האשכים יהפכו צבע ירוק-צהוב בהיר. מיד להחזיר את האשכים לחלל הבטן, ולהזריק את האשכים contralateral עם 20 microliters של PBS, ולאחר מכן לסגור את העור עם תפר כירורגי.ומ מניחים את העכבר על כרית החום של תנור תרמוסטטי. 40 דקות לאחר ההזרקה, להשתמש במספריים חדים כדי לאסוף את האשכים מכל עכבר, ולשטוף את הרקמות במיליליטר אחד של PBS קר כקרח. לאחר מכן, לתקן את האשכים ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס במשך 12 עד 24 שעות ואחריו שלוש שטיפות ב 1.5 מיליליטר של 1%PBS לכל לשטוף.לאחר התייבשות סוכרוז של 30% במהלך הלילה, מעבירים את הדגימות למסגרות הטבעה בודדות, ומכסים את הרקמות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. הגדר את הטמפרטורה של קריוסטט שלילי 20 מעלות צלזיוס ולמקום את המסגרות קריוסטט במשך כ 10 דקות עד OCT קפוא. לאחר מכן, מלא כל מסגרת הטבעה ב- OCT טרי עד שכל האשכים יכסו בכל תבנית.כאשר השכבה השנייה של OCT קפאה, לרכוש חתך בעובי חמישה מיקרומטר של כל האשכים, לכידת קטעי הרקמה על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כפי שהם מתקבלים. כדי לדמיין את הדגימות, חמם תחילה את השקופיות בתיבה לחה בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים מלוחים טריים לאגירה לכל לשטוף ולאפשר את החלקים להתייבש במשך חמש דקות מוגן מפני אור.השתמש בנייר ללא אבק כדי להסיר את כל שאריות תמיסת מלח, והעלה את הדגימות עם מדיום הרכבה בתוספת DAPI. לאחר מכן, לכסות כל דגימה עם להחליק כיסוי הפוך, ותמונה הדגימות תחת המטרה 20X של מיקרוסקופ confocal. שלושה ימים של טיפול קדמיום כלוריד גורם נזק למחסום בדיקת הדם המאפשר דיפוזיה inulin-FITC מן התא הבסיסי לתא apical של האפיתל חצי שנתי.לעומת זאת, דיפוזיה זו חסומה בבקרה אשכים שטופלו ב- PBS. היקף הנזק למחסום בדיקת הדם נקבע על ידי חישוב היחס בין המרחק של דיפוזיה אינולין-FITC לרדיוס של אותו צינור חצי שנתי. יתר על כן, מחסום בדיקת הדם שלם ב Rictor heterozygous floxed עכברי נוקאאוט בלוקים דיפוזיה inulin לאורך המחסום לתוך תא apical, בעוד עכברי נוקאאוט ריקטור מותנה להחזיק מחסום בדיקת דם בסכנה המאפשרת דיפוזיה inulin.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לספק אינולין-FITC מוכן ביום הניסוי ולשמור על הרקמה מוגנת מפני אור מאז FITC היא מולקולה רגישה לאור. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול של זרע לקוי כי הפונקציה של מחסום בדיקת הדם היא לספק microenvironment החיסיון החיסוני להשלמת meiosis ב spermatogenesis. לאחר התפתחותה, טכניקה זו מספקת דרך לחוקרים בתחום רפואת הרבייה לחקור תת פוריות ופוריות בעכברים.אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehydes יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת בגדים ומסכות פנים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

מודל Hyperandrogenic העכבר ללמוד תסמונת השחלות הפוליציסטיות

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...