Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
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이 작품은 고유 영 학자 (BK20150047), 자연 과학에 대 한 국가 키 R & D 프로그램의 중국 (2016YFA0500902), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31471228, 31771653), 강 소 과학 재단에 의해 지원 되었다 장쑤 성 (BK20140897, 14KJA180005)와 K.Z.에 소성의 혁신적이 고 기업 프로그램의 기초

모든 수행된 동물 실험 난징 의학 대학 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고. 남성 C57BL/6 마우스 제어 photoperiod 조건 하에서 유지 했다 그리고 음식과 물을 함께 제공 했다.
1입니다. 준비
<ol><li>
Microinjection 모 세관
	<ol>
<li>외경, 내부 직경와 1.0 m m, 0.8 m m와 10.0 c m, 길이 microinjection 모세를 각각 사용 합니다.</li>
		<li>모 세관 끌어당기는 사람 (그림 ...

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

Spermatogenesis seminiferous 상피에서 고은 체세포와 생식 세포에 의해 경 세 되 매우 정렬 된 동적 과정 이다 (예를 들어, Sertoli 세포)13. Sertoli 세포 구성, 웨스트가 구조가 나눕니다 seminiferous 상피는 기저와 꼭대기 구획. Meiotic 및 단일 세균 세포의 개발은 면역 장벽14을 형성 하는 꼭대기에 발생 합니다.
유독 하거나 세포 접합, 남성 ?...

포유류 spermatogenesis spermatogonial 자체-갱신 및 감 별 법 spermatocytes 통해 유사 분열, 감수 분열, 그리고 spermiogenesis를 통해 단일 정 충에는 극적인 고도로 구조화 된 과정으로 간주 됩니다. 생화학 및 형태학 상 변화 발생합니다. 개발 생식 세포는 루멘으로 seminiferous 관의 기지에서 점차적으로 이송 됩니다. 이 프로세스는 세균 세포와 Sertoli 세포1,2사이 세포 세포 접촉에 의해 통제 된다. 인접 한 Sertoli 세포 형성 seminiferous 관의 기지 근처에 있는 서 구매. 도 서 구매 실제로 나눕니다 상피는 기저 및 adluminal 구획. 8 조-IX 상피 주기의 단계 preleptotene/leptotene spermatocytes 기저 구획에서도 서 구매, adluminal 구획3입력에 걸쳐 마이그레이션합니다. 따라서,는 서 구매의 함수 감수 분열 및 spermiogenesis4,,56의 완료에 대 한 immunoprivileged microenvironment를 제공 하는. 다른 혈액 조직 장벽 (예, 혈액-뇌 장벽)만 꽉 접합 (TJs)으로 구성 된, 달리는 서 구매 (TJs, ectoplasmic 전문화, 간격 접속점, 그리고 중간 필 라 멘 트에 기초를 둔 4 명의 다른 접합에 의해 형성 된다 desmosomes) 사이 Sertoli 세포1,7.
많은 연구는 사용 유전자 변형 마우스, 바이러스 감염, 환경 유독 웨스트가 무결성7,,89의 메커니즘을 조사 하. 도 서 구매 중단 장애인된 spermatogenesis subfertility 또는 불 임 유도합니다. 생체 외에서 모델 격리 Sertoli 세포의 기본 문화에 따라 사용 되었습니다 이후 웨스트가 형성 및 무결성 확인 되었습니다 Sertoli 세포8사이 접촉에 의해 영향을 받을, 웨스트가 연구. 그러나,이 모델에는 웨스트가 역학 비보모방 정확 하 게 수 없습니다. 또한, Sertoli 세포와 생식 세포의 이러한 공동 문화는 모든 관련 구조 및 기능 구성 요소 웨스트가10,11의 반영의 능력으로 설립 되었습니다.
일반적으로, vivo에서 웨스트가 무결성 분석 실험 일반적으로 EZ-링크 Sulfo NHS LC 비오 틴 등 FITC 활용 눌린 (눌린 FITC) 작은 분자에 근거한 다. 일반적으로, biotin 또는 기초 구획에서 눌린 FITC의 보급도 서 구매 구조에 의해 차단 됩니다. 따라서, 우리는이 메서드를 사용 하 여 제어 그룹에 비해 웨스트가 손상의 정도 평가 하기 위해 수 있습니다. 도 서 구매는 특정 유형의 카드뮴 염화 (CdCl2)12, 치료 등의 자극으로 손상 될 수 있습니다 동안 웨스트가 된다 결국 지표로 adluminal 구획을 입력 작은 분자에 액세스할 수 있습니다.
초기 vivo에서 웨스트가 무결성 분석 결과 포함 biotin 또는 눌린 FITC는 수술를 포함 하 고 침략 적, 이며 복잡 한, 시간이 걸리는 경 정 맥에 주입 됩니다. 게다가, 기자 물질 순환을 통해 몸 전체를 통해 확산로 비오 틴 또는 seminiferous tubules에 눌린 FITC의 현지 농도 제한 됩니다. 또한, 조직의 노출 수 면역 반응을 유도 하 고 있다. 여기, 우리는 간단 하 고 효과적인 vivo에서 웨스트가 무결성 분석 결과 고환의 interstitium에 눌린 FITC의 작은 약 수의 직접 분사를 사용 현재. 형광 라벨 메서드를 사용 하 여 얼룩 과정이 편리 하 고, 2 차 항 체는 필요 하지 않습니다 으로입니다. 여기, 형광 성 염료는 고환 입력의 과정은 시각.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

Spermatogenesis는 고환의 seminiferous tubules에서 성숙한 정 충으로 spermatogonia의 개발 이다. 이 과정은 Sertoli 세포 접합 혈액 고환 방 벽 (도 서 구매), 포유류 몸에 있는 가장 단단한 조직 장벽 이며 2 개의 구획로 기초는 adluminal seminiferous 상피를 분리에 의해 지원 됩니다. 웨스트가 감수 분열 생식 세포에 대 한 독특한 microenvironment 만듭니다 I / II와 spermiogenesis 통해 정 충으로 postmeiotic spermatids의 개발에 대 한. 여기, 우리가 마우스 고환에서 vivo에서의 서 구매 무결성을 모니터링 하는 데 신뢰할 수 있는 분석 결과 설명 합니다. 그대로 웨스트가 seminiferous tubules의 꼭대기 구획에는 기저에서 FITC 활용 눌린의 확산을 차단합니다. 이 기술은 유전자 후보, 바이러스, 또는 서 구매 기능 또는 무결성, 쉬운 절차와 다른 방법에 비해 수술 능력의 최소한의 요구 사항에 영향을 미칠 수 있는 환경 유독 공부 위해 적당 하다.

도 서 구매 무결성 분석 결과 수행 하기 위한 실험 설정 그림 1에 표시 됩니다. 고 각각 모 세관 끌어당기는 사람와 micropipette beveler microinjection 모 세관을 선명 하 게 (그림 1A 및 1c). 서 모스 탯 히터 및 microinjection에 대 한 장비는 그림 1B 및 1 D에 나와 하 고 있습니다.
<p class="jove_c...

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An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

여기, 선물이 testes에 눌린 FITC를 주입 하 여 혈액 고환 방 벽 완전성을 평가 하는 프로토콜. 이것은 유전과 환경 요소에 의해 손상 될 수 있습니다 혈액 고환 방 벽 무결성 공부 효율적인 vivo에서 방법.

Vivo에서 하는 방법 마우스 혈액 고환 방 벽 완전성을 공부

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

이 방법은 혈액 고환 장벽 기능 또는 무결성에 영향을 미칠 수 있는 유전자 후보, 바이러스 또는 환경 독소에 관하여 생물학 필드의 혈액 고환 장벽에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 수술 3일 전에, 적어도 3 개의 8 주 오래 된 C57Black/6 남성 마우스를 치료 하는 킬로그램 당 5 밀리 그램 킬로그램 체중 카드뮴 염화 증 주사를 통해 매일 치료. 수술 당일, 75%에탄올 멸균 수술 부위에 깨끗한 조직을 놓고 온도조절히터를 섭씨 37도로 설정합니다.마취 된 마우스를 조직에 배치 한 다음 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 면도기로 복부 머리를 면도하고 75 %의 에탄올로 노출된 피부를 소독하십시오. 복벽을 노출하기 위해 선소한 땀샘 위의 1센티미터 피부 절개를 만들고, 작은 집게를 사용하여 피부를 들어 올려 복막에서 0.5센티미터 절개를 합니다.집게를 사용하여 고부와 고환 주위의 지방 패드를 검색하여 지방 패드를 조심스럽게 꺼내 서 부착 된 고환 하나를 노출하십시오. 지방 패드와 고환 아래에 9센티미터 크기의 종이를 놓고 갓 준비된 inulin-FITC 용액으로 마이크로 주입 파이펫을 적재합니다. 파이펫을 마이크로 조작기 장치에 연결하고 해부 현미경을 사용하여 튜니카 알부진 아래에 미세 주입 파이펫 팁을 부드럽게 삽입합니다.작동 레버를 천천히 회전하여 이눌린-FITC의 20 마이크로리터를 고환의 간질로 전달합니다. 배달이 성공하면 고환이 밝은 녹색-노란색으로 바뀝니다. 즉시 복강에 고환을 반환하고, PBS의 20 마이크로 리터와 모순 된 고환을 주입, 다음 수술 봉합사와 피부를 닫습니다.그리고 온도 성 히터의 열 패드에 마우스를 배치합니다. 주입 후 40 분, 각 마우스에서 고환을 수집하기 위해 날카로운 가위를 사용하고, 얼음 차가운 PBS의 1 밀리리터로 조직을 씻어. 다음으로, 12~24시간 동안 4°C에서 4%의 파라포름알데히드로 고환을 수정한 다음, 세척당 1%PBS의 1.5 밀리리터에서 3개의 세척이 가능합니다.하룻밤 사이에 30% 자당 탈수 후 샘플을 개별 포함 프레임으로 옮기고 최적의 절삭 온도 화합물로 조직을 덮습니다. 저온의 온도를 섭씨 20도로 설정하고 10월이 동결될 때까지 약 10분 동안 저온저온에 프레임을 놓습니다. 그런 다음 각 내장 프레임을 각 금형에 덮을 때까지 신선한 OCT로 채웁니다.OCT의 두 번째 층이 동결되면 각 고환의 5 마이크로 미터 두께의 단면을 획득하여 유리 현미경 슬라이드에 조직 섹션을 캡처합니다. 샘플을 이미지화하려면 먼저 실온에서 가습 된 상자에 슬라이드를 따뜻하게하십시오. 10분 후, 세척당 신선한 트리스 버퍼식 라인으로 슬라이드를 세 번 세척하고 단면도가 빛으로부터 보호되는 5분 동안 건조할 수 있도록 합니다.먼지가 없는 종이를 사용하여 잔류 식염수를 제거하고 DAPI 보충 장착 매체로 샘플을 장착합니다. 그런 다음, 반전된 커버 슬립으로 각 샘플을 커버하고, 공초점 현미경의 20X 목표하에서 샘플을 이미지화한다. 3일간의 카드뮴 염화물 처리는 혈액 고환 장벽에 손상을 입히게 하여 기저구에서 반열성 상피의 정포 구획으로 확산됩니다.대조적으로, 이 확산은 제어 PBS 처리 고환에서 차단됩니다. 혈액 고환 장벽 손상의 정도는 동일한 반열관의 반경에 이눌린-FITC 확산의 거리의 비율을 계산하여 결정된다. 또한, 이종고우스 리토르의 온전한 혈액 고환 장벽은 압정 구획으로 장벽을 가로 질러 이눌린 확산을 차단하고 조건부 리터 녹아웃 마우스는 이눌린 확산을 허용하는 손상된 혈액 고환 장벽을 가지고 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, FITC는 빛에 민감한 분자이기 때문에 실험 당일에 준비된 inulin-FITC를 전달하고 빛으로부터 보호되는 조직을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 의미는 혈액 고환 장벽의 기능이 정자 발생에 있는 meiosis의 완성을 위한 면역 특권 micro 환경을 제공하기 때문에 손상된 정자 발생의 치료로 확장됩니다. 개발 후, 이 기술은 생식 의학 분야의 연구원들이 쥐의 불임과 불임을 탐구하는 방법을 제공합니다.paraformaldehydes와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행 할 때 의류 및 얼굴 마스크를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Polycystic 난소 증후군 연구 Hyperandrogenic 마우스 모델

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...