Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National nøkkel R & D Program i Kina (2016YFA0500902), National Natural Science Foundation av Kina (31471228, 31771653), Jiangsu Science Foundation fremragende unge forskere (BK20150047), naturfag Jiangsu provinsen (BK20140897, 14KJA180005) og nyskapende og entreprenør programmet Jiangsu provinsen til K.Z.

Alle utført dyreforsøk er godkjent av Nanjing medisinske universitet. Mannlige C57BL/6 mus ble holdt under kontrollerte fotoperiode forhold og ble levert med mat og vann.
1. forberedelser
<ol><li>
Microinjection kapillærene
	<ol>
<li>Bruk microinjection kapillærene med ytre diameter, indre dimeter, og lengden på 1.0 mm, 0,8 mm og 10,0 cm, henholdsvis.</li>
		<li>Trekk glass kapillærene med en kapillær avtrekker (figur 1A). Test og Juster ...

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

Spermatogenesis foregår i seminiferous epitel og er en svært organisert og dynamisk prosess som styres av bakterie celler og somatiske celler (f.eks Sertoli celler)13. Den BTB strukturen, som er konstruert av Sertoli celler, deler seminiferous epitel i en basal og en apikale rom. Utviklingen av meiotic og haploid bakterie celler oppstår i apikale rommet som danner en immunologiske barriere14.
Funksjonen BTB kan kompromitteres...

Pattedyr spermatogenesis regnes som en svært strukturerte prosessen som omfatter spermatogonial selvtillit fornyelse og differensiering gjennom spermatocytes i haploid spermatozoa via mitose, meiose og spermiogenesis, som dramatisk biokjemiske og morfologiske endringer skje. Utvikle bakterie celler transporteres gradvis fra bunnen av seminiferous tubule mot lumen. Denne prosessen er regulert av celle-celle kontakter mellom bakterie celler og Sertoli celler1,2. Tilstøtende Sertoli cellene danner BTB som ligger nær bunnen av seminiferous tubule. BTB deler fysisk epitel i en basal og en adluminal rom. I fasen VIII - IX av epitelial syklusen, migrere preleptotene/leptotene spermatocytes fra de basale avdelinger over BTB, inn i adluminal rom3. Derfor er funksjonen av BTB å gi en immunoprivileged microenvironment for meiose og spermiogenesis4,5,6er fullført. I motsetning til andre blod-vev-barrierer (f.eks, blod - hjerne barrieren) som bare består av tett veikryss (TJs), er BTB dannet av fire forskjellige veikryss (TJs ectoplasmic spesialisering, gap veikryss og mellomliggende filament-basert desmosomes) mellom Sertoli celler1,7.
Mange studier har brukt genetisk endret mus, virusinfeksjoner og miljømessige giftstoffer for å undersøke mekanismer for BTB integritet7,8,9. BTB avbrudd induserer svekket spermatogenesis og subfertility eller infertilitet. Siden BTB dannelse og integriteten er bekreftet for kontakter mellom Sertoli celler8, en i vitro modell basert på primære kulturen i isolerte Sertoli celler har blitt brukt for BTB studie. Men kan ikke denne modellen nøyaktig etterligne BTB dynamics i vivo. Videre har ingen slike co kultur av bakterie celler med Sertoli celler blitt etablert som kan reflektere alle aktuelle strukturelle og funksjonelle komponenter BTB10,11.
Generelt, er i vivo BTB integritet analyser vanligvis basert på små molekyler, som EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin og FITC-konjugerte inulin (inulin-FITC). Normalt er spredningen av biotin eller inulin-FITC fra basale rommet blokkert av BTB struktur. Vi er derfor bruke denne metoden til å vurdere omfanget av BTB skade sammenlignet med kontroll grupper. Mens BTB kan bli svekket med visse typer stimuli, som behandling med kadmium klorid (CdCl2)12, blir BTB tilgjengelig for små molekyler, som til slutt angir adluminal rommet som indikatorer.
Tidlig i vivo BTB integritet analysen innebærer injisere biotin eller inulin-FITC i vena jugularis, som medfører kirurgi, og er invasiv, komplisert og tidkrevende. Dessuten som reporter stoffene diffus gjennom hele kroppen via sirkulasjon, er lokale konsentrasjonen av biotin eller inulin-FITC i de seminiferous tubules begrenset. Videre kan systemisk eksponering forårsake immunreaksjoner. Her presenterer vi en enkel og effektiv i vivo BTB integritet analysen muliggjør direkte injeksjon av en liten aliquot av inulin-FITC i interstitium av en testikkel. Bruke lysstoffrør merking metoden, er som om det praktisk, som sekundær antistoffer ikke er nødvendig. Her er prosessen med fluorescerende fargestoff inn testikkel visualisert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

Spermatogenesis er utvikling av spermatogonia i eldre spermatozoa i seminiferous tubules av testikkel. Denne prosessen er støttet av Sertoli celle veikryss på blod-testikkel barrieren (BTB), som er strammeste vev barrieren i pattedyr kroppen og segregerer seminiferous epitel i to avdelinger, en basal og en adluminal. BTB skaper en unik microenvironment for bakterie celler i meiose jeg / II og for utvikling av postmeiotic spermatids i spermatozoa via spermiogenesis. Her beskriver vi en pålitelig analysen for å overvåke BTB integriteten til mus testikkel i vivo. En intakt BTB blokkerer spredningen av FITC-konjugerte inulin fra de basale apikale rommet av seminiferous tubules. Denne teknikken er egnet for å studere genet kandidater, virus eller miljømessige giftstoffer som kan påvirke BTB funksjonen eller integritet, med en enkel prosedyre og et minimalt krav av kirurgiske ferdigheter sammenlignet med alternative metoder.

Det eksperimentelle oppsettet for å utføre BTB integritet analysen er vist i figur 1. Trekk og skjerpe microinjection kapillærene kapillær avtrekker og brønnene beveler, henholdsvis (figur 1A og 1 C). Termostatiske varmeapparatet og utstyr for microinjection er illustrert i figur 1B og 1 D.
<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Her presenterer vi en protokoll for å vurdere blod-testikkel barriere integritet ved å injisere inulin-FITC inn testiklene. Dette er en effektiv i vivo -metode for å studere blod-testikkel barriere integritet som kan kompromitteres av genetiske og miljømessige elementer.

En i Vivo -metode for å studere musen blod-testikkel barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i blod-tester barrieren av biologi felt om genkandidater, virus, eller miljøgifter som kan påvirke blod-testis barriere funksjon eller integritet. Tre dager før operasjonen, behandle minst tre åtte uker gamle C57Black/6 mannlige mus daglig med en fem milligram per kilo kroppsvekt kadmiumklorid via intraperitoneal injeksjon. På operasjonsdagen plasserer du et rent vev over et 75% etanolsterilisert kirurgisk område og setter en termostatvarmer til 37 grader Celsius.Plasser en bedøvet mus på vevet, og bekreft deretter mangel på respons på tåklemmen. Barber magehåret med en barbermaskin, og desinfiser den eksponerte huden med 75% etanol. Lag en en centimeter hud snitt over preputial kjertler for å utsette bukveggen, og bruke små tang for å løfte huden for å gjøre en 0,5-centimeter snitt i bukhinnen.Bruk tangen til å søke etter fettputer rundt epididymis og testis, forsiktig trekke fett pads ut for å avsløre en vedlagt testis. Legg et ni centimeter stort papirark under fettputene og testisene, og legg i en mikroinjeksjonspipette med nylaget inulin-FITC-løsning. Koble pipetten til en mikromanipulatorenhet, og bruk et dissekeringsmikroskop til å sette mikroinjeksjonspipetten forsiktig inn under tunikaalbugineaen.Roter driftsspaken langsomt for å levere 20 mikroliter av inulin-FITC inn i interstitium av testis. Hvis leveringen er vellykket, vil testis slå en lys grønn-gul farge. Umiddelbart returnere testis til bukhulen, og injisere contralateral testis med 20 mikroliter pbs, deretter lukke huden med en kirurgisk sutur.Og plasser musen på varmeputen på en termostatvarmer. 40 minutter etter injeksjonen, bruk skarp saks for å samle testiklene fra hver mus, og vask vevet i en milliliter iskald PBS. Deretter fikser testiklene i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius i 12 til 24 timer etterfulgt av tre vasker i 1,5 milliliter på 1% PBS per vask.Etter 30% sukrose dehydrering over natten, overføre prøvene til individuelle innebygging rammer, og dekke vev med optimal skjæretemperatur sammensatte. Sett temperaturen på en kryostat til negativ 20 grader Celsius og plasser rammene i kryostaten i ca 10 minutter til OCT er frosset. Fyll deretter hver innebyggingsramme med frisk OCT til hele testene er dekket i hver form.Når det andre laget av OCT har frosset, få en fem-mikrometer-tykke tverrsnitt av hver testis, fange vevseksjoner på glass mikroskop lysbilder som de er oppnådd. For å se for deg prøvene, varm først lysbildene i en fuktet boks ved romtemperatur. Etter 10 minutter vask lysbildene tre ganger i fersk Tris-bufret saltvann per vask og la seksjonene tørke i fem minutter beskyttet mot lys.Bruk støvfritt papir til å fjerne eventuell restsvann, og monter prøvene med DAPI-supplert monteringsmedium. Deretter dekker du hver prøve med en omvendt dekkseddel, og bilde prøvene under 20X-målet for et konfokalt mikroskop. Tre dager med kadmiumkloridbehandling forårsaker skade på blod-testis barrieren slik at inulin-FITC diffusjon fra basalrommet til det apiske rommet i det seminiferøse epitelet.I motsetning er denne diffusjonen blokkert i kontroll PBS-behandlede testiklene. Omfanget av blod-tester barriereskader bestemmes ved å beregne forholdet mellom avstanden til inulin-FITC diffusjon til radiusen av samme seminiferøse tubule. Videre blokkerer den intakte blodtestbarrieren i heterozygous Rictor floxed knockout mus inulin diffusjon over barrieren inn i det apiske rommet, mens betingede Rictor knockout mus har en kompromittert blodprøvebarriere som tillater inulin diffusjon.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å levere inulin-FITC forberedt på dagen for eksperimentet og for å holde vevet beskyttet mot lys siden FITC er et lysfølsomt molekyl. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg til behandling av nedsatt spermatogenese fordi funksjonen til blod-testis barrieren er å gi et immun-privilegert mikromiljø for ferdigstillelse av meiose i spermatogenese. Etter utviklingen gir denne teknikken en måte for forskere innen reproduktiv medisin å utforske subfertilitet og infertilitet hos mus.Ikke glem at arbeid med paraformaldehyder kan være ekstremt farlig, og at forholdsregler som bruk av klær og ansiktsmasker alltid bør tas når du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Bruke<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturer av Whole føtale organer å studere utviklingsprosesser i løpet Mouse organogenesen

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcellelignende<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale eksplantater å studere Tidlig Neural utviklingstrekk<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metode for å få dedifferensierte fettcellene

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro og in vivo-modeller for å studere hornhinne endotel-mesenchymale Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metode for Time-Lapse Imaging av Dyrkede Rat mesenteric mikrovaskulære nettverk

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av larver sebrafisk som et dyr-modellen for å undersøke Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metoden å studere utviklingen av embryonale kylling vev

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

En Hyperandrogenic mus modell å studere polycystisk ovariesyndrom

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...