Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

Эта работа была поддержана национальной ключ R & D программы Китая (2016YFA0500902), Национальный фонд Китая естественных наук (31471228, 31771653), научный фонд Цзянсу для выдающихся молодых ученых (BK20150047), естественные науки Фонд провинции Цзянсу (BK20140897, 14KJA180005) и инновационной и предпринимательской программы провинции Цзянсу на К.Ж

Все выполненные эксперименты на животных были утверждены Комитетом медицинского университета Нанкин. Самцов мышей C57BL/6 хранились в контролируемых фотопериода условиях и были поставлены с пищей и водой.
1. Подготовка
<ol><li>
Микроинъекции капилляров
	<ol>
<li>Исполь?...

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

Сперматогенез занимает место в эпителии семенных и является весьма упорядоченный и динамичный процесс, который регулируется зародышевых клеток и соматических клеток (например, клеток Сертоли)13. BTB структуры, которая построена путем клеток Сертоли, делит семенны?...

У млекопитающих сперматогенез считается весьма структурированный процесс, который охватывает сперматогониальные самообновлению и дифференциация через сперматоцитах в haploid сперматозоидов через митоз, мейоз и spermiogenesis, во время которого драматического биохимические и морфологические изменения происходят. Постепенно развивающиеся клетки семенозачатка перевозятся от основания семенных канальцах сторону просвета. Этот процесс регулируется ячеек контактов между зародышевых клеток и клеток Сертоли1,2. Соседние клетки Сертоли образуют BTB, который расположен рядом с базой семенных канальцах. BTB физически делит эпителия на базальную и adluminal отделения. Во время этапа VIII - IX эпителиальных цикла, сперматоцитах preleptotene/leptotene от базальной отсеков мигрируют по BTB, ввод в adluminal отсеков3. Таким образом функция BTB является предоставить immunoprivileged микроокружение для завершения мейоза и spermiogenesis4,5,6. В отличие от других крови тканевые барьеры (например, blood - brain барьер) которые состоят только из плотных узлов (сомони) BTB формируется четыре различных узлов (сомони, ectoplasmic специализаций, разрыв соединения и среднего на основе накаливания Десмосомы) между Сертоли клетки1,7.
Многие исследования использовали генетически измененных мышей, вирусных инфекций и экологических токсикантов расследовать механизмов BTB целостности7,8,9. BTB срыв индуцирует нарушение сперматогенеза и менструальной или бесплодия. Поскольку формирование БТБ и целостность были подтверждены пострадать от контактов между клеток Сертоли8, была использована модель в пробирке , основанный на первичной культуре изолированных клеток Сертоли BTB исследования. Однако эта модель не может точно имитировать BTB динамика в естественных условиях. Кроме того нет такого совместного культуры зародышевых клеток с клеток Сертоли был создан как способной отражать всех соответствующих структурных и функциональных компонентов BTB10,11.
В общем в естественных условиях BTB целостности анализов обычно основаны на малых молекул, как EZ-Link сульфогруппу-ГСЗ-LC-биотин и конъюгированных FITC инулин (инулин FITC). Как правило распространение биотин или инулина FITC от базальной отсека блокируется BTB структуры. Таким образом мы имеем возможность использовать этот метод для оценки масштабов ущерба BTB, по сравнению с контрольными группами. В то время как BTB может быть скомпрометирована с определенными типами раздражителей, таких как лечение с Кадмий хлористый (2CdCl)12, BTB становится доступной для малых молекул, которые в конечном итоге войти в adluminal отделение как индикаторы.
Начале в vivo BTB целостности assay включает инъекции биотина или инулина FITC в яремной вены, которая включает операции и инвазивных, сложным и трудоемким. Кроме того как репортер веществ диффузной через все тело через кровообращение, местные концентрация биотина или инулина FITC в семенных канальцев ограничен. Кроме того системного воздействия могут вызвать иммунных реакций. Здесь мы представляем простой и эффективный в vivo BTB целостности пробирного включение прямого впрыска небольшой Алиготе инулин FITC в интерстиции яичка. Флуоресцентные метки метода, процесс окрашивания удобно использовать, как вторичные антитела не требуются. Здесь визуализировать процесс Люминесцентную краску, введя яички.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

Сперматогенез является развитие сперматогонии в зрелых сперматозоидов в семенных канальцев яичек. Этот процесс поддерживается соединения клеток Сертоли на крови яички барьер (BTB), который является плотные ткани барьер в организме млекопитающих и сегрегирует семенных эпителия в двух отсеков, базальный и adluminal. BTB создает уникальный микроокружение для клетки семенозачатка в мейоз I / II и для развития postmeiotic сперматид в сперматозоидов через spermiogenesis. Здесь мы описываем надежный пробирного контролировать целостность BTB мыши яичка в естественных условиях. Нетронутыми BTB блокирует распространение FITC-конъюгированных инулин из базальных апикальной отсек семенных канальцев. Этот метод подходит для изучения генов кандидатов, вирусы или экологических токсикантов, которые могут повлиять на функцию BTB или целостность, с простой процедурой и минимальное требование хирургических навыков, по сравнению с альтернативными методами.

Экспериментальная установка для выполнения анализа целостности BTB показан на рисунке 1. Тянуть и точить микроинъекции капилляров с капиллярной съемник и микропипеткой оборудованием, соответственно (рис. 1A и 1 C). Термостатическ...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Здесь мы представляем протокол для оценки целостности барьер крови яичка путем впрыскивать инулин FITC в яичках. Это эффективно в vivo метод для изучения крови яички барьер целостности, которая может быть скомпрометирована генетических и экологических элементов.

В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области анализа крови биологических полей о генных кандидатов, вирусов или экологических токсинов, которые могут повлиять на функцию барьера крови-тестиса или целостности. За три дня до операции, лечить по крайней мере три восьминедельных C57Black/6 мышей мужского пола ежедневно с пятью миллиграммами на килограмм хлорида кадмия массы тела через внутриперитонеамерную инъекцию. В день операции поместите чистую ткань на 75%-стерилизованную этанолом хирургическую зону и установите термостатический обогреватель до 37 градусов по Цельсию.Поместите анестезированную мышь на ткань, а затем подтвердите отсутствие реакции на щепотку ноша. Бритье брюшной волосы бритвой, и дезинфицировать открытые кожи с 75%этанола. Сделайте один сантиметр разреза кожи над препутальными железами, чтобы разоблачить брюшной стенки, и использовать небольшие миппы, чтобы поднять кожу, чтобы сделать 0,5-сантиметровый разрез в брюшной полости.Используйте типсы для поиска жира колодки вокруг эпидидимиса и яичка, тщательно потянув жира колодки, чтобы разоблачить один прилагается яичка. Поместите девятисемейметровый лист бумаги под жировые прокладки и яички и загрузите микроинъекцию пипеткой со свежеприготовленным раствором инулин-ФИТК. Подключите пипетку к блоку микроманипулятора и используйте рассеченный микроскоп, чтобы аккуратно вставить наконечник микроинъекции пипетки под туника альбугинеа.Медленно поверните операционный рычаг, чтобы доставить 20 микролитров инулина-FITC в интерстиций яичка. Если доставка будет успешной, яичка превратят ярко-зелено-желтого цвета. Немедленно верните яички в брюшную полость и ввилите контралатеральный яичк с помощью 20 микролитров PBS, затем закройте кожу хирургическим швом.И поместите мышь на тепловую панель термостатического обогревателя. Через 40 минут после инъекции используйте острые ножницы, чтобы собрать яички с каждой мыши, и мыть ткани в один миллилитр ледяной PBS. Далее, исправить яички в 4%paraformaldehyde при четырех градусах по Цельсию в течение 12 до 24 часов, а затем три моет в 1,5 миллилитров 1%PBS за стирку.После 30% обезвоживания сахарозы на ночь, передать образцы в отдельных встраивания кадров, и покрыть ткани с оптимальным резки температурного соединения. Установите температуру криостата до отрицательных 20 градусов по Цельсию и поместите кадры в криостат в течение примерно 10 минут, пока OCT не замерз. Затем заполните каждый встраиваемый каркас свежим ОКТ до тех пор, пока весь яичк не будет покрыт каждой формой.Когда второй слой OCT замерз, приобрести пять микрометров толщиной поперечных сечений каждого яичка, захватив ткани разделы на стеклянный микроскоп слайды, как они получены. Для изображения образцов сначала нагревают горки во влажной коробке при комнатной температуре. Через 10 минут, мыть слайды три раза в свежем Tris-буферный солевой раствор для мытья и дайте разделам высохнуть в течение пяти минут защищены от света.Используйте бумагу без пыли, чтобы удалить остаточный солевой раствор и смонтировать образцы с помощью крепления DAPI-дополненной среды. Затем накройте каждый образец перевернутым крышкой скольжения, и изображение образцов под 20X цель конфокального микроскопа. Три дня лечения хлоридом кадмия приводит к повреждению гембиозного барьера, позволяющего диффузию инулина-FITC из базального отсека в апиальный отсек семенного эпителия.В отличие от этого, эта диффузия блокируется в контрольных тестах, обработанных PBS. Степень повреждения гемового барьера определяется путем расчета соотношения расстояния диффузии инулин-ФИТК к радиусу той же семенной трубочки. Кроме того, нетронутый гемовой барьер у гетерозиготных мышей Rictor floxed блокирует диффузию инулина через барьер в апиальный отсек, в то время как условные мыши Rictor knockout обладают скомпрометированным гемовензелитным барьером, который позволяет диффузию инулина.При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы доставить инулин-FITC подготовлены в день эксперимента и сохранить ткани защищены от света, поскольку FITC является светочувствительным молекулы. Последствия этого метода распространяются на терапию нарушения сперматогенеза, потому что функция гематотейного барьера заключается в том, чтобы обеспечить иммунно-привилегированную микроокноронику для завершения мейоза при сперматогенезе. После своего развития, этот метод обеспечивает путь для исследователей в поле воспроизводственной микстуры исследовать subfertility и неплодородность в мышах.Не забывайте, что работа с параформальдехиды может быть чрезвычайно опасным и что меры предосторожности, такие как ношение одежды и маски для лица всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

С помощью<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Вертикальный воздушно-капельных Культуры всей фетальных органов по изучению процессов развития во Mouse органогенеза

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Стволовых клеток, как<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбриональные эксплантов для изучения раннего развития, особенности нейронных<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Эффективный метод получения Дедифференцированные жировых клеток

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

В пробирке и в естественных моделей для изучения роговичный эндотелий мезенхимальных перехода

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Метод ЗАМЕДЛЕННАЯ визуализации культивируемых Rat брыжеечные микрососудистых сетей

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Создание личиночной данио рерио как модель животного к расследованию Trypanosoma cruzi подвижности In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Культура organotypic метод для изучения развития тканей эмбриона курицы

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenic мыши модель для изучения синдром поликистозных яичников

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...