Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por la nacional clave de R & D programa de China (2016YFA0500902), el nacional Ciencias naturales Fundación de China (31471228, 31771653), la Fundación de ciencia de Jiangsu para jóvenes distinguidos eruditos (BK20150047), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) y el programa de innovador y emprendedor de la provincia de Jiangsu a K.Z.

Todos los experimentos con animales realizados han sido aprobados por el Comité de la Universidad médica de Nanjing. Ratones machos C57BL/6 fueron mantenidos bajo condiciones de fotoperíodo controlado y proveyeron de alimentos y agua.
1. preparaciones
<ol><li>
Capilares de microinyección
	<ol>
<li>Utilice capilares de microinyección con un diámetro externo, diámetro interno y longitud de 1.0 mm, 0,8 mm y 10,0 cm, respectivamente.</li>
		<li>Tire los capilares de vidri...

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

Espermatogénesis tiene lugar en el epitelio seminífero y es un proceso altamente ordenado y dinámico que está regido por las células germinales y células somáticas (p. ej., las células de Sertoli)13. La estructura de la BTB, que está construida por células de Sertoli, divide el epitelio seminífero en un básico y un compartimiento apical. El desarrollo de las células germinales meióticas y haploides se produce en el compartimento apical que forma una barrera inmunol?...

Espermatogénesis mamíferos se consideran un proceso altamente estructurado que comprende espermatogonias de auto renovación y diferenciación a espermatocitos en espermatozoides haploides por mitosis, meiosis y espermiogénesis, que dramático ocurren cambios bioquímicos y morfológicos. Células germinales en desarrollo progresivamente son transportadas desde la base de los túbulos seminíferos hacia el lumen. Este proceso está regulado por los contactos de la célula entre las células germinales y células de Sertoli1,2. Las células de Sertoli adyacentes forman la BTB se encuentra cerca de la base del túbulo seminífero. La BTB físicamente divide el epitelio en un básico y un compartimento adluminal. Durante las etapas VIII - IX del ciclo epitelial, espermatocitos preleptotene/leptoteno de los compartimentos basals migran a través de la BTB, entrar en los compartimientos adluminal del3. Por lo tanto, la función de la BTB es proporcionar un microambiente de immunoprivileged para la terminación de la meiosis y espermiogénesis4,5,6. A diferencia de otras sangre-tejido barreras (e.g., barrera blood - brain) que se componen sólo de uniones estrechas (TJs), el BTB está formado por cuatro diferentes cruces (TJs, especializaciones ectoplasmáticos, ensambladuras de gap y base de filamento intermedio desmosomas) entre el Sertoli de células1,7.
Muchos estudios han utilizado ratones modificados genéticamente, infecciones por virus y sustancias tóxicas ambientales para investigar mecanismos de BTB integridad7,8,9. La interrupción de la BTB induce la espermatogénesis deteriorada y subfertilidad o infertilidad. Puesto que la formación de la BTB y la integridad han sido confirmados para ser afectado por los contactos entre las células de Sertoli8, un modelo en vitro basado en cultivo primario de células de Sertoli aisladas se ha utilizado para el estudio BTB. Sin embargo, este modelo no puede imitar exactamente BTB dinámica en vivo. Por otra parte, esa cultura no Co de las células germinales con las células de Sertoli se ha establecido como capaz de reflejar todos los componentes estructurales y funcionales relevantes de la BTB10,11.
En general, en vivo ensayos de integridad BTB se basan normalmente en moléculas pequeñas, como EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina y conjugados con FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la difusión de la biotina o inulina-FITC desde el compartimiento basal es bloqueada por estructura BTB. Por lo tanto, somos capaces de utilizar este método para evaluar la magnitud del daño de la BTB en comparación con grupos control. Mientras que TBB puede verse comprometida con ciertos tipos de estímulos, tales como el tratamiento con cadmio cloruro (CdCl2)12, BTB se convierte en accesible a moléculas pequeñas, que finalmente entran en el compartimento adluminal como indicadores.
Un temprano en vivo TBB integridad ensayo implica la inyección de biotina o inulina-FITC en la vena yugular, que consiste en una cirugía y es invasiva, complicado y desperdiciador de tiempo. Además, como las sustancias reportero difunden a través de todo el cuerpo vía la circulación, la concentración local de biotina o inulina-FITC en los túbulos seminíferos es limitada. Por otra parte, la exposición sistémica puede inducir reacciones inmunes. Aquí, presentamos un sencillo y eficaz en vivo TBB integridad ensayo que permite la inyección directa de una pequeña alícuota de inulina-FITC en el intersticio de un testículo. Usando el fluorescente etiquetado método, el proceso de tinción es conveniente, como anticuerpos secundarios no son necesarios. Aquí, se visualiza el proceso de colorante fluorescente en el testículo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

Espermatogénesis es el desarrollo de espermatogonias en espermatozoides maduros en los túbulos seminíferos de los testículos. Este proceso es apoyado por las ensambladuras de la célula de Sertoli en la barrera del sangre-testis (BTB), que es la barrera de tejido más apretada en el cuerpo mamífero y segrega el epitelio seminífero en dos compartimentos, una basal y adluminal un. La BTB crea un microambiente único de las células germinales en la meiosis I / II y para el desarrollo de postmeiotic espermátides en espermatozoides por medio de la espermiogénesis. Aquí, describimos un análisis confiable para monitorear la integridad BTB de testículo de ratón en vivo. Un BTB intacto bloquea la difusión de la inulina FITC conjugado desde la basal en el compartimento apical de los túbulos seminíferos. Esta técnica es adecuada para el estudio de candidatos de genes, virus o tóxicos ambientales que pueden afectar la función BTB o integridad, con un procedimiento fácil y un requisito mínimo de habilidades quirúrgicas en comparación con métodos alternativos.

El montaje experimental para realizar el análisis de integridad BTB se muestra en la figura 1. Tire y afilar los capilares de la microinyección con tirador capilar y beveler micropipeta, respectivamente (figura 1A y 1C). El calentador termostático y equipo para la microinyección se ilustran en la figura 1B y 1D.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within...

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An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la integridad de barrera Hematotesticular inyectando inulina-FITC en los testículos. Este es un método eficiente en vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular que puede estar comprometida por elementos genéticos y ambientales.

Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la barrera de los análisis de sangre de los campos de la biología sobre los candidatos a genes, los virus o las toxinas ambientales que pueden afectar la función o integridad de la barrera de los análisis de sangre. Tres días antes de la cirugía, tratar al menos tres ratones macho C57Black/6 de ocho semanas de edad diariamente con un cloruro de cadmio de cinco miligramos por kilogramo de peso corporal a través de la inyección intraperitoneal. El día de la cirugía, coloque un tejido limpio sobre un área quirúrgica esterilizada con etanol al 75% y establezca un calentador termostático en 37 grados centígrados.Coloque un ratón anestesiado sobre el tejido y luego confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del final. Afeitar el cabello abdominal con una afeitadora, y desinfectar la piel expuesta con 75%etanol. Haga una incisión cutánea de un centímetro por encima de las glándulas preputiales para exponer la pared abdominal, y use pequeños fórceps para levantar la piel para hacer una incisión de 0,5 centímetros en el peritoneo.Utilice los fórceps para buscar almohadillas de grasa alrededor del epidídimo y testis, tirando cuidadosamente de las almohadillas de grasa para exponer un testículo unido. Coloque un pedazo de papel de nueve centímetros debajo de las almohadillas de grasa y los testículos, y cargue una pipeta de microinyección con solución de inulina-FITC recién preparada. Conecte la pipeta a una unidad microempresador y utilice un microscopio de disección para insertar suavemente la punta de la pipeta de microinyección debajo de la túnica albuginea.Gire lentamente la palanca de operación para entregar 20 microlitros de la inulina-FITC en el intersticio de los testículos. Si la entrega es exitosa, los testículos se volverán de color verde-amarillo brillante. Inmediatamente devolver los testículos a la cavidad abdominal, e inyectar los testículos contralaterales con 20 microlitros de PBS, a continuación, cerrar la piel con una sutura quirúrgica.Y coloque el ratón sobre la almohadilla de calor de un calentador termostático. 40 minutos después de la inyección, utilice tijeras afiladas para recoger los testículos de cada ratón y lave los tejidos en un mililitro de PBS helado. A continuación, fijar los testículos en 4%paraformaldehído a cuatro grados Celsius durante 12 a 24 horas seguido de tres lavados en 1,5 mililitros de 1%PBS por lavado.Después de 30%deshidratación de sacarosa durante la noche, transfiera las muestras a marcos de incrustación individuales y cubra los tejidos con un compuesto de temperatura de corte óptimo. Ajuste la temperatura de un criostato a 20 grados Celsius negativos y coloque los fotogramas en el criostato durante unos 10 minutos hasta que el PTU esté congelado. A continuación, llene cada marco de incrustación con OCT fresco hasta que todo el testis esté cubierto en cada molde.Cuando la segunda capa de OCT se haya congelado, adquiera secciones transversales de cinco micrómetros de espesor de cada testículo, capturando las secciones de tejido en diapositivas de microscopio de vidrio a medida que se obtienen. Para tomar una imagen de las muestras, primero caliente los portaobjetos en una caja humidificada a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, lave los portaobjetos tres veces en solución salina fresca tamponada por comprimidos por lavado y deje que las secciones se sequen durante cinco minutos protegidas de la luz.Utilice papel libre de polvo para eliminar cualquier solución salina residual y monte las muestras con un medio de montaje complementado por DAPI. A continuación, cubra cada muestra con un resbalón de cubierta invertido e imagine las muestras bajo el objetivo 20X de un microscopio confocal. Tres días de tratamiento con cloruro de cadmio causan daños en la barrera blood-testis permitiendo la difusión inulina-FITC desde el compartimiento basal hasta el compartimiento apical del epitelio semicífero.Por el contrario, esta difusión se bloquea en el control de los testículos tratados con PBS. El alcance del daño de la barrera blood- testis se determina calculando la relación entre la distancia de difusión inulina-FITC y el radio del mismo tubulo semiínfero. Además, la barrera intacta de los testis de sangre en los ratones noqueados de Rictor heterocigoto bloquea la difusión de la inulina a través de la barrera en el compartimiento apical, mientras que los ratones noqueadores condicionales de Rictor poseen una barrera de testis de sangre comprometida que permite la difusión de la inulina.Al intentar este procedimiento, es importante recordar entregar inulina-FITC preparado el día del experimento y mantener el tejido protegido de la luz ya que FITC es una molécula sensible a la luz. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de espermatogénesis deteriorada porque la función de la barrera blood-testis es proporcionar un microambiente de privilegio inmune para la finalización de la meiosis en la espermatogénesis. Después de su desarrollo, esta técnica proporciona una manera para que los investigadores en el campo de la medicina reproductiva exploren la subfertilidad y la infertilidad en ratones.No olvide que trabajar con paraformaldehídos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de prendas y máscaras faciales al realizar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Un método eficaz para obtener células de grasa Dediferenciado

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

En vitro y en modelos in vivo para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Un modelo de ratón Hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...