Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

Detta arbete fick stöd av den nationella tangenten R & D Program i Kina (2016YFA0500902), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31471228, 31771653), Stiftelsen Jiangsu vetenskap för framstående unga forskare (BK20150047), den naturliga vetenskapen Grunden i Jiangsu-provinsen (BK20140897, 14KJA180005) och programmet innovativa och entreprenöriella i Jiangsu-provinsen till K.Z.

Alla genomförda djurförsök har godkänts av utskottet för Nanjing Medical University. Manliga C57BL/6 möss var hålls under kontrollerade fotoperiod förhållanden och försågs med mat och vatten.
1. förberedelser
<ol><li>
Mikroskop kapillärer
	<ol>
<li>Använda Mikroskop kapillärer med en yttre diameter och inre dimeter längd 1,0 mm, 0.8 mm och 10,0 cm, respektive.</li>
		<li>Dra glas kapillärer med en kapillär avdragare (figur 1A)....

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

Spermatogenes sker i de sädesproducerande epitelet och är en mycket ordnad och dynamisk process som styrs av könsceller och somatiska celler (t.ex., Sertoli celler)13. BTB struktur, som är konstruerad av Sertoli celler, delar av sädesproducerande epitel i en basal och en apikal fack. Utvecklingen av meiotiska och haploida könsceller uppstår i apikala facket som bildar en immunologisk barriär14.
Funktionen BTB kan äventy...

Däggdjur spermatogenes anses vara en mycket strukturerad process som omfattar spermatogoniala självförnyelse och differentiering genom spermatocyter in haploida spermier via Mitos, meios och spermiogenesis, under vilken dramatisk biokemiska och morfologiska förändringar inträffar. Utveckla könsceller transporteras gradvis från basen av de seminifera tubuli mot lumen. Denna process regleras av cell-cell kontakter mellan könsceller och Sertoli celler1,2. Angränsande Sertoli celler bildar den BTB som ligger nära basen av de seminifera tubuli. BTB delar fysiskt epitelet i en basal och en adluminal fack. Under skeden VIII - IX av epitelial cykeln, migrerar preleptotene/leptotene spermatocyter från de basala fack över de BTB, in adluminal fack3. Funktionen av BTB därför att ge en immunoprivileged närmiljön för slutförandet av meios och spermiogenesis4,5,6. Till skillnad från andra blod-vävnad hinder (t.ex., blod - hjärnbarriären) som endast består av åtsittande föreningspunkter (TJs), bildas BTB av fyra olika korsningar (TJs, ektoplasmiskt inriktningar, gap-junctions och intermediär filament-baserade desmosomes) mellan Sertoli celler1,7.
Många studier har använt genetiskt modifierade möss, virusinfektioner och miljögifter för att undersöka mekanismer BTB integritet7,8,9. BTB störningar inducerar försämrad spermatogenes och stamcellsforskningen eller infertilitet. Eftersom BTB bildning och integritet har bekräftats för att påverkas av kontakter mellan Sertoli celler8, en in vitro- modell baserad på primära kultur av isolerade Sertoli celler har använts för BTB studie. Denna modell inte kan dock noggrant efterlikna BTB dynamics in vivo. Dessutom har ingen sådan samtidig kultur av könsceller med Sertoli celler etablerats som kan återspegla alla relevanta strukturella och funktionella komponenter i BTB10,11.
I allmänhet baseras i vivo BTB integritet analyser vanligtvis på små molekyler, såsom EZ-anknyter Sulfo-NHS-LC-Biotin och FITC-konjugerad inulin (inulin-FITC). Normalt blockeras av biotin eller inulin-FITC från den basala kupén diffusion av BTB struktur. Därför är vi kunna använda denna metod för att bedöma omfattningen av BTB skador jämfört med kontrollgrupperna. Medan BTB kan äventyras med vissa typer av stimuli, såsom behandling med kadmium klorid (CdCl2)12, blir BTB tillgänglig för små molekyler, som så småningom in i adluminal facket som indikatorer.
Ett tidigt i vivo BTB integritet test innebär att injicera biotin eller inulin-FITC i halsvenen, som innebär kirurgi och invasiva, komplicerade och tidskrävande. Förutom, som reporter ämnen diffunderar genom hela kroppen via cirkulationen, lokala koncentrationen av biotin eller inulin-FITC i sädeskanalerna är begränsad. Systemisk exponering kan dessutom framkalla immuna reaktioner. Här presenterar vi en enkel och effektiv i vivo BTB integriteten analysen möjliggör direkt injektion av en liten alikvot av inulin-FITC i interstitium av en testikel. Använder den fluorescerande märkning metoden, är färgning processen bekvämt, eftersom sekundära antikroppar inte krävs. Här är processen av fluorescerande färgämne in testiklarna visualiseras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

Spermatogenesen är utvecklingen av spermatogonier till mogna spermier i sädeskanalerna i testiklarna. Denna process stöds av Sertoli celler korsningar på den blod-testis-barriären (BTB), som är snäv vävnad barriären i däggdjur kroppen och segregerar sädesproducerande epitel i två fack, en basal och en adluminal. BTB skapar en unik närmiljön för könsceller i meios I / II och för utvecklingen av postmeiotic spermatids till spermier via spermiogenesis. Här beskriver vi en tillförlitlig test för att övervaka BTB integritet mus testiklarna i vivo. En intakt BTB blockerar diffusionen av FITC-konjugerad inulin från den basala i apikala facket av sädeskanalerna. Denna teknik är lämplig för att studera genen kandidater, virus eller miljögifter som kan påverka BTB funktion eller integritet, med ett enkelt förfarande och ett minimalt krav på kirurgisk kompetens jämfört med alternativa metoder.

Experimental set-up för att utföra BTB integriteten analysen visas i figur 1. Dra och vässa Mikroskop kapillärer med kapillär avdragare och mikropipett fasmaskin, respektive (figur 1A och 1 C). Termostatstyrd värmare och utrustning för Mikroskop illustreras i figur 1B och 1 D.
Fi...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma den blod-testis-barriär integriteten genom att injicera inulin-FITC i testiklarna. Detta är en effektiv i vivo metod att studera blod-testis-barriären integritet som kan äventyras av genetiska och miljömässiga faktorer.

En In Vivo -Metod för att studera mus blod-Testis barriär integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor i blod-testis barriär av biologi fält om genkandidater, virus, eller miljögifter som kan påverka blod-testis barriärfunktion eller integritet. Tre dagar före operationen, behandla minst tre åtta veckor gamla C57Black/6 hanmöss dagligen med en fem milligram per kilo kroppsvikt kadmiumklorid via intraperitoneal injektion. På dagen för operationen, placera en ren vävnad över en 75%etanol-steriliserade kirurgiska området och ställa in en termostatvärmare till 37 grader Celsius.Placera en sövd mus på vävnaden och bekräfta sedan en brist på svar på tå nypa. Raka bukhåret med en rakapparat, och desinficera den exponerade huden med 75%etanol. Gör en en centimeter hud snitt ovanför de preputial körtlar att exponera bukväggen, och använda små tövråkar för att lyfta huden för att göra en 0,5-centimeters snitt i bukhinnan.Använd tövråkar för att söka efter fett kuddar runt epididymis och testis, försiktigt dra fett kuddar ut för att exponera en bifogad testis. Placera ett nio centimeter papper under fettkuddarna och testisen, och ladda en mikroinjektionspipett med nyberedda inulin-FITC-lösning. Anslut pipetten till en mikromanipulatorenhet, och använd ett dissekerande mikroskop för att försiktigt sätta in mikroinjektionspipettspetsspetsen under tunica albuginea.Rotera långsamt driftsspaken för att leverera 20 mikroliter av inulin-FITC i interstitiumet av testis. Om leveransen lyckas kommer testis att bli en ljusgrön-gul färg. Omedelbart tillbaka testis till bukhålan, och injicera kontralateral testis med 20 mikroliter av PBS, stäng sedan huden med en kirurgisk sutur.Och placera musen på värmedynan på en termostatvärmare. 40 minuter efter injektionen, använd vass sax för att samla testikorna från varje mus, och tvätta vävnaderna i en milliliter iskall PBS. Därefter fixar testiken i 4%paraformaldehyd vid fyra grader Celsius i 12 till 24 timmar följt av tre tvättar i 1,5 milliliter på 1%PBS per tvätt.Efter 30%sackaros uttorkning över natten, överföra proverna till enskilda inbäddning ramar, och täcka vävnaderna med optimal skärtemperatur förening. Ställ in temperaturen på en kryostat till negativa 20 grader Celsius och placera ramarna i kryostaten i ca 10 minuter tills OCT är frusen. Fyll sedan varje inbäddningsram med färskt OCT tills hela testisen är täckt i varje form.När det andra skiktet av OCT har frusit, förvärva en fem-mikrometer-tjocka tvärsnitt av varje testis, fånga vävnadssektioner på glas mikroskop diabilder som de erhålls. För att avbilda proverna, värm först bilderna i en befuktad låda i rumstemperatur. Efter 10 minuter, tvätta objektglasen tre gånger i färsk Tris-buffrad saltlösning per tvätt och låt sektionerna torka i fem minuter skyddade från ljus.Använd dammfritt papper för att avlägsna eventuellt restsaltlösning, och montera proverna med DAPI-kompletterat monteringsmedium. Täck sedan varje prov med en inverterad omslagssnedsteg och avbilda proverna under 20X-målet med ett konfokalmikroskop. Tre dagars behandling med kadmiumklorid orsakar skador på blodtestisbarriären som tillåter inulin- FITC-diffusion från basalfacket till det apikala facket i seminiferösepitelet.I motsats till detta är denna diffusion blockerad i kontroll PBS-behandlade testi- rar. Blodtestisbarriärskadans omfattning bestäms genom beräkning av förhållandet mellan avståndet för inulin-FITC-diffusion och radien för samma seminiferous tubuli. Vidare blockerar den intakta blodtestbarriären i heterozygous Rictor floxed knockout möss inulin diffusion över barriären i det apikala facket, medan villkorlig Rictor knockout möss har en komprometterad blod-testis barriär som tillåter inulin diffusion.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att leverera inulin-FITC beredd på dagen för experimentet och att hålla vävnaden skyddas från ljus eftersom FITC är en ljuskänslig molekyl. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig till terapi av nedsatt spermatogenes eftersom funktionen av blod-testis barriären är att ge en immun-privilegierad mikromiljö för slutförandet av meios i spermatogenes. Efter dess utveckling, denna teknik ger ett sätt för forskare inom området reproduktiv medicin att utforska subfertilitet och infertilitet hos möss.Glöm inte att arbeta med paraformaldehyder kan vara extremt farligt och att försiktighetsåtgärder som att bära kläder och ansiktsmasker alltid bör vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Använda<em&gt; Ex vivo</em&gt; Upright Dropp Kulturer av hela organ hos fostren att studera utvecklingsprocesser under Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcellsliknande<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonala Explantat att studera tidig Neural Utvecklings funktioner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metod för att få avdifferentierade fettceller

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro och in vivo-modeller för att studera hornhinnan Endothelial-mesenkymala Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metod för time-lapse avbildning av odlade Rat Mesenteric Mikrovaskulära Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av Larval zebrafiskar som ett djur-modell för att undersöka Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

En Hyperandrogenic musmodell att studera polycystiskt ovariesyndrom

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...