Name: an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

Bu eser ayırt edici genç bilim adamları için (BK20150047), Doğa Bilimleri ulusal anahtar R & D Çin programı (2016YFA0500902), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31471228, 31771653), Jiangsu Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Jiangsu Eyaleti (BK20140897, 14KJA180005) ve Jiangsu Eyaleti K.Z. için yenilikçi ve girişimci Program temeli

Tüm gerçekleştirilen hayvan deneyleri Nanjing Tıp Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanmış olması. Erkek C57BL/6 fare kontrollü photoperiod koşullar altında tutuldu ve yiyecek ve su ile temin edildi.
1. hazırlıkları
<ol><li>
Mikroenjeksiyon kılcal
	<ol>
<li>Mikroenjeksiyon kılcal bir dış çap, iç dimeter ve 1.0 mm, 0.8 mm ve 10,0 cm, uzunluğu ile sırasıyla kullanın.</li>
		<li>Cam kılcal kapiller çektirme (Şekil 1A)...

<ol>
	<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li><li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons.">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).</li><li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seamless+trespass:+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis.">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li><li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue?.">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?.</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li><li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis.">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier:+Its+Biology+and+Regulation.">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li><li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice.">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li><li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults.">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li><li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis.">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li><li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential.">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li><li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+'blood-testis+barrier'+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat.">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis.">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception.">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics.">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li><li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats:+a+quantitative+autoradiographic+study.">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li><li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+cadherin/catenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis?.">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?.</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis.">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture:+I.+Morphological+and+ultrastructural+study.">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+(BTB):+An+In+Vivo+Assay.">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li></ol>

Sperma seminifer epitel yer alır ve germ hücreleri ve somatik hücreler tarafından yönetilir son derece düzenli ve dinamik bir süreçtir (Örneğin, Sertoli hücreleri)13. Sertoli hücreleri tarafından oluşturulur, BTB yapısı bir bazal ve apikal bir bölme seminifer epitel ayırır. Segregasyonun ve haploit germ hücre gelişimi bir bağışıklık bariyer14oluşturan apikal kompartımanda oluşur.
BTB işlev tarafınd...

Memeli sperma spermatogonial kendini yenileme ve spermatocytes aracılığıyla hangi dramatik sırasında farklılaşma yolu ile spermiogenesis, mitoz ve mayoz haploit sperm hücreleri içine kapsayan son derece yapılandırılmış bir süreç olarak kabul edilir biyokimyasal ve morfolojik değişiklikler oluşur. Gelişmekte olan germ hücreleri aşamalı olarak lümen doğru Seminifer tübül tabanından taşınmaktadır. Bu işlem germ hücreleri ve Sertoli hücreleri1,2arasında hücre-hücre kişiler tarafından düzenlenmiştir. Bitişik Sertoli hücreleri Seminifer tübül Bankası bulunan BTB oluştururlar. BTB fiziksel olarak bir bazal ve bir adluminal bölme epitel ayırır. VIII - IX epitel döngüsünün aşamaları sırasında bazal bölmeleri gelen preleptotene/leptotene spermatocytes adluminal bölmeleri3girme BTB karşıdan karşıya geçirin. Bu nedenle, BTB fonksiyonu mayoz ve spermiogenesis4,5,6tamamlanması için bir immunoprivileged microenvironment sağlamaktır. Sadece sıkı kavşak (TJs) oluşan diğer kan doku engelleri farklı olarak (Örneğin, kan - beyin bariyerini), BTB tarafından dört farklı kavşak (TJs, ektoplazmik Uzmanlıklar, gap kavşaklar ve ara filaman tabanlı oluşturulur desmosomes)1,7arasında Sertoli hücreleri.
Birçok çalışma mekanizmaları BTB bütünlük7,8,9araştırmak için genetik olarak değiştirilmiş fare, virüs enfeksiyonları ve çevre toxicants kullandık. BTB bozulma Engelli sperma ve subfertility ya da kısırlık neden olmaktadır. BTB oluşumu ve bütünlük kişiler arasında Sertoli hücreleri8etkilenmeye teyit edilmiştir beri izole Sertoli hücre birincil kültür temel bir vitro modeli kullanılan BTB çalışma için. Ancak, bu model doğru BTB dinamiği içinde vivotaklit edemez. Ayrıca, germ hücre Sertoli hücreleri ile eş böyle kültür yok yeteneğine sahip tüm ilgili yapısal ve işlevsel bileşenleri BTB10,11yansıtan olarak kurulmuştur.
Genel olarak, VIVO BTB bütünlük deneyleri genellikle küçük moleküllerin, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin ve FITC Birleşik inulin (inulin-FITC) dayanır. Normalde, biotin veya inulin-FITC bazal yuvası üzerinden difüzyon BTB yapısı tarafından engellenir. Bu nedenle, biz kontrol grubu ile karşılaştırıldığında BTB hasar ölçüde değerlendirmek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. BTB sonunda adluminal bölme göstergeleri olarak girin küçük moleküller için erişilebilir süre BTB uyaranlara, kadmiyum klorür (CdCl2)12, tedaviyle gibi belirli türleri ile tehlikeye girebilir.
Bir erken vivo içinde BTB bütünlük tahlil biotin veya inulin-FITC ameliyat içerir ve invaziv, karmaşık ve zaman alıcı juguler ven enjekte içerir. Ayrıca, muhabir maddeler kan dolaşımı yoluyla tüm vücuda diffüz olarak biotin veya inulin-FITC seminifer tübüllerin içinde yerel konsantrasyonu sınırlıdır. Ayrıca, sistemik pozlama bağışıklık tepkileri neden olabilir. Burada, inulin-FITC küçük bir aliquot bir testis interstitium içine direkt enjeksiyon etkinleştirme basit ve etkili içinde vivo BTB bütünlük tahlil mevcut. İkincil antikorlar gerekli değildir olarak etiketleme yöntemi floresan, boyama işlemi uygun, kullanmaktır. Burada, floresan boya testis girme sürecinin görüntülenir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:803px;" width="802">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary puller&#160;</td>
			<td style="width:231px;">SUTTER INSTRUMENT (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10x PBS</td>
			<td style="width:231px;">Hyclone (USA)</td>
			<td style="width:139px;">SH30258.01</td>
			<td>dilution to 1&#215; in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion microscope slides</td>
			<td style="width:231px;">CITOGLAS (China)</td>
			<td style="width:139px;">80312-3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">655198-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:231px;">Zeiss (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dust-free paper</td>
			<td style="width:231px;">Kimberly-Clark (USA)</td>
			<td style="width:139px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inulin-FITC</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microinjection capillaries</td>
			<td style="width:231px;">Zhengtianyi (China)</td>
			<td style="width:139px;">BJ-40</td>
			<td>1.0 mm &#215; 0.8 mm&#160; &#215; 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette beveler</td>
			<td style="width:231px;">NARISHIGE (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">EG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td style="width:231px;">SAKURA (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:231px;">Sigma (USA)</td>
			<td style="width:139px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:231px;">Merck (Germany)</td>
			<td style="width:139px;">P11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaver&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Yashen (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:231px;">Nikon (JAPAN)</td>
			<td style="width:139px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:231px;">Stronger (China)</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>scissors, forceps, needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td style="width:231px;">KDL (China)</td>
			<td style="width:139px;">20163150518</td>
			<td>0.45 mm &#215; 0.16 mm RW LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermostatic heater</td>
			<td style="width:231px;">KELL (Nanjing, China)</td>
			<td style="width:139px;">KEL-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td >10x TBS, pH 7.6</td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 M Tris</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A600194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1.37 M Nacl</td>
			<td style="width:231px;">Sangon Biotech (China)</td>
			<td style="width:139px;">A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo method to study mouse blood-testis barrier integrity

Sperma testis seminifer tübüllerin içinde olgun sperm hücreleri içine spermatogonia gelişmedir. Bu işlem Sertoli hücre kavşaklar, memeli vücuttaki dar doku engeldir ve iki bölmeleri, bir bazal ve bir adluminal seminifer epitel diğer kan-testis bariyeri (BTB), tarafından desteklenmektedir. BTB germ hücreleri için benzersiz bir microenvironment mayoz oluşturur ı / II ve sperm ile spermiogenesis içine postmeiotic spermatids gelişimi için. Burada, fare testis içinde vivobütünlüğünü BTB izlemek için güvenilir bir tahlil açıklayın. Sağlam bir BTB FITC Birleşik seminifer tübüllerin apikal bölmesinin inulin bazal üzerinden difüzyon engeller. Bu teknik gen adaylar, virüsler veya BTB işlevi veya kolay bir prosedür ve cerrahi becerileri alternatif yöntemlerine göre en az bir şartı ile bütünlüğü etkileyen çevresel toxicants çalışmak için uygundur.

BTB bütünlük tahlil gerçekleştirmek için deneysel set-up Şekil 1' de gösterilen. Çekin ve mikroenjeksiyon kılcal bir kılcal çektirmenin ve micropipette beveler, sırasıyla keskinleştirmek (Şekil 1A ve 1 C). Termostatik ısıtıcı ve mikroenjeksiyon donatımı Şekil 1B ve 1 Dgösterilmiştir.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity at JoVE.com

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Burada, inulin-FITC testis enjekte edilerek kan-testis bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu genetik ve çevresel öğeleri tarafından tehlikeye girebilir kan-testis bariyer bütünlüğünü incelemek için bir verimli vivo içinde yöntemidir.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Bu yöntem, gen adayları, virüsler veya kan testis bariyer fonksiyonunu veya bütünlüğünü etkileyebilecek çevresel toksinler hakkında biyoloji alanlarının kan testibariyerindeki anahtar soruların yanıtlatılabilir. Ameliyattan üç gün önce, en az üç sekiz haftalık C57Black/6 erkek fareleri günlük olarak vücut ağırlığı kadmiyum klorür başına beş miligram intraperitoneal enjeksiyon ile tedavi edin. Ameliyat günü, %75 etanol sterilize edilmiş cerrahi alanın üzerine temiz bir doku yerleştirin ve termostatik ısıtıcıyı 37 santigrat dereceye ayarlayın.Doku üzerine bir anestezili fare yerleştirin, sonra parmak sıkışma yanıt eksikliği onaylamak. Bir tıraş makinesi ile karın saç tıraş ve% 75 etanol ile maruz kalan cilt dezenfekte. Karın duvarını ortaya çıkarmak için preputial bezlerin üzerinde bir santimetrelik deri kesi yapmak ve periton 0.5 santimetrelik bir kesi yapmak için cildi kaldırmak için küçük forsepskullanın.Epididim ve testis etrafında yağ pedleri aramak için forseps kullanın, dikkatle bir ekli testis ortaya çıkarmak için yağ yastıkları çekerek. Yağ pedleri ve testis altında dokuz santimetrelik bir kağıt parçası yerleştirin ve taze hazırlanmış inulin-FITC çözeltisi ile bir mikroenjeksiyon pipet yükleyin. Pipeti bir mikromanipülatör ünitesine bağlayın ve mikroenjeksiyon pipet ucunu tunica albuginea'nın altına hafifçe yerleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.Testisinterstitium içine inulin-FITC 20 mikrolitre teslim etmek için yavaş yavaş çalışma kolu döndürün. Teslimat başarılı olursa, testis parlak yeşil-sarı renk dönecektir. Hemen karın boşluğuna testis dönmek ve pbs 20 mikrolitre ile kontralateral testis enjekte, sonra cerrahi bir dikiş ile cilt kapatın.Ve fareyi termostatik ısıtıcının ısı yastığının üzerine yerleştirin. Enjeksiyondan 40 dakika sonra, her fareden testisleri toplamak için keskin makas kullanın ve dokuları bir mililitre buz gibi PBS'de yıkayın. Daha sonra, 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede %4 paraformaldehit testislerini düzeltin ve ardından yıkama başına %1 PBS'nin 1,5 mililitresinde üç yıkama yapın.Bir gecede %30 sakaroz dehidratasyonundan sonra, numuneleri tek tek gömme çerçevelere aktarın ve dokuları optimum kesme sıcaklığı bileşiğiyle kaplayın. Bir kriyostat'ın sıcaklığını negatif 20 santigrat dereceye ayarlayın ve kareleri OCT dondurulana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca kriyostatta yerleştirin. Daha sonra, tüm testis her kalıp kaplı olana kadar taze OCT ile her gömme çerçeve doldurun.OCT'nin ikinci katmanı donduğunda, her testisin beş mikrometre kalınlığındakesitlerini elde ederek doku kesitlerini cam mikroskop slaytlarına geçirin. Örnekleri görüntülemek için, önce slaytları oda sıcaklığında nemli bir kutuda ısıtın. 10 dakika sonra, slaytları her yıkama da taze Tris-tamponlu tuzlu üç kez yıkayın ve bölümlerin ışıktan korunan beş dakika kurumasını bekleyin.Artık tuzlu eti çıkarmak için tozsuz kağıt kullanın ve numuneleri DAPI destekli montaj ortamına monte edin. Daha sonra, her numuneyi ters bir kapak fişiyle kaplayın ve bir konfokal mikroskobun 20X hedefi altında örnekleri görüntüleyin. Kadmiyum klorür tedavisi üç gün kan-testis bariyerinde inulin-FITC difüzyon bazal bölmesi seminiferous epitel apikal bölmesi sağlayan hasara neden olur.Buna karşılık, bu difüzyon kontrol PBS tedavi testislerinde bloke edilir. Kan-testis bariyer hasarının boyutu, inulin-FITC difüzyonmesafesinin aynı seminiferous tübülün yarıçapına oranı hesaplanarak belirlenir. Ayrıca, heterozigot Rictor'daki sağlam kan testi bariyeri, nakavt farebloklarını bariyer boyunca apikal bölmeye doğru itmiyet emdirirken, koşullu Rictor nakavt farelerin inulin difüzyonuna izin veren kan testis bariyeri vardır.Bu prosedürü denerken, deney günü hazırlanan inulin-FITC'yi teslim etmeyi ve FITC ışığa duyarlı bir molekül olduğu için dokuyu ışıktan korumayı unutmamak önemlidir. Bu tekniğin etkileri bozulmuş spermatogenezin tedavisine kadar uzanır, çünkü kan-testis bariyerinin işlevi spermatogenezde meyyozisin tamamlanması için bağışıklık ayrıcalıklı bir mikroortam sağlamaktır. Gelişiminden sonra, bu teknik farelerde subfertilite ve kısırlık keşfetmek için üreme tıbbı alanında araştırmacılar için bir yol sağlar.Paraformaldehitlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken giysi ve yüz maskesi takmagibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Polikistik over sendromu çalışmaya Hyperandrogenic fare modeli

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...