Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
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PCH 特派团支助基金支持本手稿中报告的研究。作者想感谢丹尼尔. 格里菲斯拍摄了数字中使用的图像。

用1x 磷酸缓冲盐水 (PBS) 对雄性成年 C57Bl6 小鼠5、幼年大大鼠和成年 Megabrain 大大鼠进行了全脑和 hemisected 的优化。4% 多聚甲醛6。在两性和不同年龄的老鼠和老鼠的其他品系也可以取得类似的结果。为这篇手稿生成数据的研究使用了大鼠, 并获得了亚利桑那大学机构动物保育和使用委员会的批准, 并根据实验室的护理和使用指南对实验动物进行了照顾。动物<sup cla...

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	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

在这一过程中应考虑到 Megabrain 及其周围环境的温度必须不断监测, 以防止组织的解冻和再冷冻。大脑只能从-20 °c 冷冻库中除去, 每次被接触和留在恒温器, 随着温度的升高, 组织解冻和 refreezes, 导致果冻像质地和异常的组织完整性10。因此, 最好同时切断 Megabrain。
组织固定和抗冻是本议定书的关键部分, 以尽量减少冰晶形成, 减少外部微生物生长, 停止酶反应...

在这里, 我们提出了一种新方法的协议, 我们称之为 Megabrain, 发展为 cryosection 多鼠大脑同时为下游免疫组化程序。Megabrain 允许生产含有多种动物组织的单张幻灯片。这项技术已被优化, 以切割冠状部分从9成年大鼠半球, 或5成人全脑, 同时。因此, 该技术最适用于大型免疫组化研究或其他分析, 对从一大群动物的幻灯片安装的脑组织进行。
免疫组化涉及使用特定的抗体针对感兴趣的蛋白质, 以了解和表征其表达和细胞变化的特定组织1,2,3。免疫组化的应用在神经科学研究中普遍存在, 在其他科学学科中, 帮助对大脑的细胞和分子的理解4。涉及许多动物和脑部的大规模研究可以是资源和时间密集型的。因此, Megabrain 的发展有多方面的理由: 减少花 cryosectioning、安装和染色组织的时间, 同时使用较少的试剂。此外, 在同一回合中简化过程和染色多个大脑的能力有助于缓解染色批次之间的一些变异性, 这是免疫组化3的局限性。此外, 切片 Megabrain 是一个节省时间的替代品切片单个冰冻啮齿动物的大脑, 并允许快速比较的组织之间的动物, 甚至治疗组的显微技术。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

组织学和免疫组化是常规的分析方法, 以可视化显微解剖和本地化蛋白质在生物组织。在神经科学, 以及其他科学领域, 这些技术被使用。免疫组化可以做在幻灯片上的组织或自由浮动部分。准备幻灯片安装的示例是一个时间密集型的过程。以下技术的协议, 称为 Megabrain, 减少了 cryosection 和安装大脑组织的时间高达 90%, 通过结合多个大脑到一个单一的冰冻块。此外, 这种技术减少了染色回合之间的变异, 在一个大的组织化学研究。在下游免疫组化分析中, 利用啮齿动物脑组织对现有技术进行了优化;然而, 它可以应用到不同的科学领域, 使用 cryosectioning。

这个过程的一个积极的结果是, 组织是平的在幻灯片上, 没有气泡或眼泪, 在他们被冻结的方向。组织切片是均匀间隔和容易辨认, 由于良好的位置的大脑在 OCT 和良好的符号如图 1所示。假设大脑组织是从类似年龄的动物那里收集的, 并且该组织在 OCT 中正确排列, 那么在幻灯片上收集的部分应该代表一个类似的冠状平面, 允许动物之间的大脑区域进行?...

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Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

在这里, 我们提出一个协议, 冻结和切片的大脑组织从多个动物作为一个玩意替代处理单一的大脑。这减少了免疫组化过程中的染色变异性, 减少了时间 cryosectioning 和成像。

多鼠脑的同时 Cryosectioning

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

这种节省时间的方法减少了神经科学研究中免疫组织化学程序几轮之间的变异性，以优化解剖学和局部蛋白质和组织之间的可视化。这项技术的主要优点是，通过将多个大脑组合成一个冷冻块，减少了冷冻和安装脑组织的时间。虽然这项技术针对啮齿动物大脑的冠状部分进行了优化，但它可以适应下垂或横向部分或不同类型的组织，如肌肉或肝脏。在成功的转心输注后，在PBS中25毫升小瓶中修复动物的大脑，24小时使用4%的甲状甲醛。在此之后，使用钝倾斜钳将大脑从半甲醛中去除。将大脑转移到一个小瓶中，在TBS中用大约20毫升的30%蔗糖溶液。保持大脑和溶液，直到他们沉入小瓶的底部。接下来，将一个500毫升的玻璃烧杯放在冰桶的干冰床上。然后将300至400毫升异丙烷倒入烧杯中。保持负45和负50摄氏度之间的异丙烷。在台面上，用最佳切割温度或 OCT 化合物填充一次性嵌入模具，大约一半满。使用针头清除模具上的任何气泡。使用钝尖钳将第一个大脑从蔗糖溶液中去除。然后使用新的剃须刀刀片去除小脑和嗅觉灯泡，然后再分离半球。接下来，给大脑一个数字命名系统。使用钝钳，拿起大脑被放置在第二位，并定向与侧被削减第一面朝上。将大脑放入 OCT 中，并使用钳子调整其位置，直到它独立站立。此技术的一个关键修改是位置 1 中的空白。此空间被指定，以便于识别巨脑方向，从而识别与每个大脑相关的动物。所有大脑都位于模具中后，添加足够的 OCT 来覆盖大脑顶部，然后用针头去除任何气泡。用钳子握住模具的一角，确保钳子不会部分淹没在 OCT 中。然后，将模具降低为异丙烷，使模具的底部三分之一被淹没。30 秒后，将整个模具降低至异丙烷中，然后从钳子中释放。三分钟后，使用钳子从异丙烷上去除模具。立即将模具及其内装物包裹在铝箔中，并适当地贴上标签。将巨型脑转移到负 20 摄氏度的冰柜中至少 24 小时。首先，将低温柜的温度设置为负 19 摄氏度。从冰柜中取出巨型脑，放在低温箱中。然后在低温恒温器中放置一个夹头和两个薄尖的画笔。在此之后，使用巨型脑标识号和幻灯片编号标记幻灯片，然后将幻灯片放在幻灯片加热器上。接下来，解开巨型脑，用剃刀刀片切割模具的角落。将一层薄薄的 OCT 分配到夹头上。然后迅速将巨型脑放在夹头上。OCT 完全冻结后，在巨型脑的两侧周围涂抹两毫米的 OCT 层，并允许其沿着夹头的两侧运行。使用剃须刀刀片从夹头的侧面和底部清除多余的 OCT。首先，将装有巨型脑的夹头放在低温恒温器的夹头上。然后将低温恒温器设置为所需的厚度。根据需要修剪 OCT 和组织，以达到所需的大脑区域进行组织采集。然后降低防卷板，直到它放在舞台上，转动低温手柄，采取一个单一的部分。慢慢提起防卷板，小心组织部分不接触。轻轻地使用画笔展开组织部分，直到它平躺。如果需要，使用画笔握住 OCT 平，以防止滚动。然后从幻灯片加热器上取下幻灯片，将幻灯片标签侧悬停在巨型脑部分上方，并允许其粘到幻灯片上。快速将 PBS 滴到组织部分。使用浸在 PBS 中的细尖画笔，刷掉组织部分的任何气泡并展开组织，以便它平躺在幻灯片上。最后，将幻灯片放在幻灯片加热器上干燥 45 分钟，并在负 80 摄氏度处存储幻灯片。在这个协议中，来自九种动物的脑组织同时被准备和冷冻。冷冻后，可以进行H&E染色，以评估低温保护质量。电离钙结合适配器分子一或 Iba1 微胶质染色的代表性结果表明，每个研究大脑在单个巨型脑上一致染色。在尝试此程序时，重要的是要记住在冻结巨脑时持续监测温度，以防止开裂或解冻，然后重新冻结导致组织完整性异常的组织。不建议将不同的治疗组隔离在单独的巨脑中，因为这可能在染色过程中产生组之间的差异，并减少成像和分析期间的偏置和主观性。不要忘记，使用甲状甲醛可能非常危险，在执行此过程时，应始终采取预防措施，例如佩戴 PBE 和在发动机罩中工作。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

同时在啮齿动物脑功能磁共振成像和电

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

科研

神经科学

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

前全体体内培养，发展的果蝇大脑

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

同时脑电图，实时测量的啮齿动物的大脑皮质中的神经元活动的乳酸浓度与Optogenetic的操作

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

同时电生理记录和抑制剂在啮齿动物大脑微注射

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

原发性脑多巴胺能神经元的分离，培养和长期维持胚胎脑鼠类

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Interneuron 前体 Homochronic 移植早期小鼠脑的研究

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

果蝇幼虫和成年脑的代谢分析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Abbiategrasso 脑库协议，用于收集、处理和描述老化的大脑

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

小鼠大脑的自由漂浮免疫染色

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

来自多个小生物体的自动多模态刺激和同时神经元记录

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...