Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

PCH missie steunfondsen ondersteund het onderzoek gemeld in dit manuscript. De auteurs bedank Daniel Griffiths voor het nemen van de beelden die worden gebruikt in de cijfers.

De Megabrain-techniek is geoptimaliseerd met behulp van geheel en hemisected hersenen van mannelijke volwassen C57Bl6 muizen5, jonge Sprague-Dawley ratten en volwassen Sprague-Dawley ratten die transcardially geperfundeerd met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS waren) gevolgd door 4% paraformaldehyde6. Vergelijkbare uitkomsten kunnen worden bereikt in andere stammen van de muis en rat, in beide geslachten en op verschillende leeftijden. De studie voor het genereren va...

<ol>
	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

Dit moet worden beschouwd tijdens deze procedure dat de temperatuur van de Megabrain en de omgeving moet voortdurend worden gecontroleerd om te voorkomen dat ontdooien en weer bevriezen van het weefsel. De hersenen kan alleen worden verwijderd uit de diepvries van-20 ° C tot aan 3 keer als telkens als het wordt aangeraakt en links in de cryostaat, met een warmere wisselende temperatuur, het weefsel ontdooit en refreezes, waardoor een gelei als textuur en abnormale weefsel integriteit10. Daarom is...

Hier presenteren we het protocol voor een nieuwe methode, die wij Megabrain noemen, ontwikkeld om meerdere knaagdier gelijktijdig voor downstream immunohistochemische procedures hersenen cryosection. Een Megabrain zorgt voor de productie van afzonderlijke dia's met weefsel van meerdere dieren. Deze techniek is geoptimaliseerd voor het knippen van coronale secties uit 9 volwassen ratten hemisferen, of 5 volwassen volledige hersenen, tegelijkertijd. De techniek is daarom meest toepasselijke in grote immunohistochemische studies of andere analyses gedaan op dia gemonteerde hersenweefsel van een grote cohort van dieren.
Immunohistochemistry impliceert het gebruik van specifieke antilichamen gericht tegen proteïnen van belang om te begrijpen en karakteriseren van hun expressie en cellulaire veranderingen in specifieke weefsel1,2,3. Het gebruik van immunohistochemistry heerst in onderzoek neurowetenschap, onder andere wetenschappelijke disciplines, helpend in het cellulaire en moleculaire begrip van de hersenen-4. Grootschalige studies waarbij veel dieren en delen van de hersenen kunnen zowel de resource en de tijd intensief zijn. Als zodanig, is er een veelzijdig grondgedachte achter de ontwikkeling van het Megabrain: om tijd doorgebracht cryosectioning, montage en kleuring van weefsel, tijdens het gebruik bijgevolg minder reagentia. Bovendien is de mogelijkheid om het proces te stroomlijnen en vlek meerdere hersenen in dezelfde ronde draagt bij tot verlichting van enkele van de variabiliteit tussen de partijen, een beperking van immunohistochemistry3kleuring. Daarnaast segmenteren van een Megabrain is een tijdbesparende alternatief voor het segmenteren van individuele bevroren knaagdier hersenen en zorgt voor een snelle vergelijking van weefsel tussen dieren of zelfs behandelgroepen door microscopie technieken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

Histologie en immunohistochemistry zijn routine analysemethoden te visualiseren van microscopische anatomie en lokaliseren van eiwitten in biologische weefsels. In neurowetenschap, evenals een overvloed van andere wetenschappelijke disciplines, worden deze technieken gebruikt. Immunohistochemistry kan worden gedaan op dia gemonteerd weefsel of de zwevende delen. Voorbereiding van monsters dia gemonteerde is een intensief proces van tijd. Het volgende protocol voor een techniek, genaamd de Megabrain, verminderd de tijd genomen om cryosection en mount hersenweefsel door tot 90% door het combineren van meerdere hersenen in een enkele diepgevroren blok. Bovendien, deze techniek verminderd variabiliteit tussen de rondes, in een grote histochemische studie kleuring gezien. De huidige techniek is geoptimaliseerd voor het gebruik van knaagdier hersenweefsel in downstream immunohistochemische analyses; echter kan het worden toegepast op verschillende wetenschappelijke gebieden die gebruikmaken van cryosectioning.

Een positief eindresultaat voor deze procedure is weefsel dat ligt plat op de dia, met geen blaasjes of tranen, in de richting waarin ze werden bevroren. Weefselsecties zijn gelijkmatig uit elkaar en herkenbaar als gevolg van goede plaatsing van de hersenen in de LGO en de goede notatie zoals aangetoond in Figuur 1. Ervan uitgaande dat het hersenweefsel werd bijeengezocht uit dieren van dezelfde leeftijd, en dat het weefsel was correct wordt uitgelijnd in de ...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Deze tijdbesparende methode vermindert de variabiliteit tussen rondes van immunohistochemische procedures in neurowetenschappelijke studies om de visualisatie van anatomie en lokale eiwitten en weefsel te optimaliseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het vermindert de tijd die nodig is om cryosection en monteren hersenweefsel door het combineren van meerdere hersenen in een enkele bevroren blok. Terwijl deze techniek is geoptimaliseerd voor coronale secties van knaagdier hersenen, het kan worden aangepast aan sagittale of dwarse secties of verschillende soorten weefsels zoals spier of lever.Na een succesvolle transcardiale perfusie, post-fix de hersenen van de dieren in een 25 milliliter flacon van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 24 uur. Gebruik hierna stompe fkrachten om de hersenen uit het paraformaldehyde te verwijderen. Breng de hersenen over naar een flesje met ongeveer 20 milliliter van 30% sacharose oplossing in TBS.Houd de hersenen en oplossing totdat ze zinken naar de bodem van de flacon. Plaats vervolgens een 500 milliliter glazen beker op een bedje van droog ijs in een ijsemmer. Giet vervolgens 300 tot 400 milliliter isopentane in het bekerglas.Houd de isopentane tussen negatieve 45 en negatieve 50 graden Celsius. Op de bank top, vul een wegwerp inbedding schimmel ongeveer halverwege vol met optimale snijtemperatuur of OCT verbinding. Gebruik een naald om eventuele luchtbellen te verwijderen uit de mal.Gebruik de stompe getipte tangen om de eerste hersenen uit de sacharoseoplossing te verwijderen. Gebruik vervolgens een nieuw scheermesje om het cerebellum en de reuklampen te verwijderen voordat u de hemisrond scheidt. Geef de hersenen vervolgens een numeriek naamgevingssysteem.Gebruik stompe tangen, pak de hersenen te worden geplaatst in positie twee, en oriënteren met de zijkant te worden gesneden eerst naar boven gericht. Laat de hersenen in de OKT zakken en gebruik de pincet om zijn positie aan te passen totdat deze onafhankelijk staat. Een belangrijke wijziging van deze techniek is de lege ruimte in positie één.Deze ruimte is aangewezen om een eenvoudige identificatie van de megabrain oriëntatie mogelijk te maken en daarom het dier te identificeren dat aan elk brein is geassocieerd. Nadat alle hersenen zijn geplaatst in de mal, voeg voldoende OKT om de toppen van de hersenen te dekken, gebruik dan een naald om eventuele luchtbellen te verwijderen. Houd de hoek van de mal met tangen ervoor te zorgen dat de tangen niet gedeeltelijk ondergedompeld in de LGO.Dan, lager de mal in de isopentane, zodat de onderste derde van de mal wordt ondergedompeld. Na 30 seconden, laat de hele mal in de isopentane en laat het van de tangen. Na drie minuten, gebruik maken van de tang om de mal te verwijderen uit de isopentane.Wikkel onmiddellijk de mal en de inhoud ervan in aluminiumfolie en label het op de juiste manier. Breng de megabrain voor minimaal 24 uur over in een negatieve vriezer van 20 graden Celsius. Stel eerst de temperatuur van de cryostatkast in op negatieve 19 graden Celsius.Haal het megabrein uit de vriezer en leg het in de cryostat. Plaats dan een chuck en twee dunne getipte kwasten in de cryostat. Label hierna de dia's met het megabrein identificatienummer en het schuifnummer en leg de dia's op de diawarmer.Vervolgens, uitpakken van de megabrain en gebruik een scheermesje om de hoeken van de mal te snijden. Doe een dun laagje OCT op de chuck. Plaats dan snel de megabrain op de chuck.Nadat de OCT volledig bevroren is, breng je een twee millimeter laag OCT aan rond de zijkanten van het megabrein en laat het langs de zijkanten op de klem lopen. Gebruik een scheermesje om overtollige OCT te verwijderen van de zijkanten en onderkant van de chuck. Ten eerste, plaats de chuck gemonteerd met de megabrain op de chuck hoofd van de cryostat.Zet vervolgens de cryostat op de gewenste dikte. Trim de OKT en weefsel als dat nodig is om de gewenste hersenregio voor weefselverzameling te bereiken. Laat vervolgens de anti-rolplaat zakken totdat deze op het podium rust en draai de cryostat-handgreep om een enkele sectie te nemen.Til langzaam de anti-rolplaat op, voorzichtig dat de weefselsectie niet wordt aangeraakt. Gebruik voorzichtig de kwasten om de weefselsectie uit te rollen totdat het plat ligt. Houd indien nodig de OCT plat met behulp van de kwasten om rollen te voorkomen.Verwijder vervolgens de schuif van de diawarmer en beweeg de schuiflabelzijde naar beneden over het megabreingedeelte en laat deze aan de dia kleven. Breng snel een druppel PBS aan op de weefselsectie. Met behulp van een fijne getipte penseel gedoopt in PBS, borstel uit alle bubbels in het weefsel sectie en ontvouwen het weefsel, zodat het plat op de glijbaan ligt.Tot slot, plaats de dia op de dia warmer te drogen voor 45 minuten en bewaar de dia op negatieve 80 graden Celsius. In dit protocol werden hersenweefsel van negen dieren tegelijkertijd voorbereid en cryosectioned. Na cryosectioning kan H&E-kleuring worden uitgevoerd om de cryoprotectiekwaliteit te beoordelen.Representatieve resultaten van geïoniseerde calcium binding adapter molecuul een of Iba1 kleuring van microglia tonen consistente vlekken tussen elke studie hersenen op een enkele megabrain. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om voortdurend toezicht op de temperatuur tijdens het bevriezen van de megabrain om te voorkomen dat kraken of ontdooien en vervolgens opnieuw invriezen van het weefsel wat leidt tot abnormale weefselintegriteit. Het wordt afgeraden om verschillende behandelingsgroepen in afzonderlijke megahersenen te scheiden, omdat dit variantie tussen groepen tijdens het beitsen kan creëren en bias en subjectiviteit tijdens beeldvorming en analyse kan verminderen.Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van PBE en het werken in een kap moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Gelijktijdig fMRI en elektrofysiologie bij knaagdieren Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo kweken van Whole, Het ontwikkelen van Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Abbiategrasso Brain Bank Protocol voor het verzamelen, verwerken en karakteriseren van veroudering hersenen

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Geautomatiseerde multimodale stimulatie en gelijktijdige neuronale opname van meerdere kleine organismen

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...