Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
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Fonds de soutien de Mission PCH appuyé la recherche signalée dans ce manuscrit. Les auteurs tiennent à remercier Daniel Griffiths pour prendre les images utilisées dans les chiffres.

La technique de Megabrain a été optimisée à l’aide de cerveaux ensemble et hemisected de mâles adultes du souris C57Bl65et jeunes rats Sprague-Dawley rats Sprague-Dawley adultes qui ont été perfusé avec 1 x une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de transcardially par 4 % de paraformaldéhyde6. Des résultats similaires pouvant être effectuées dans les autres souches de souris et de rats, chez les deux sexes et à des âges différents. L’étu...

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	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

Il devrait être considéré au cours de cette procédure que la température de la Megabrain et ses environs doit être constamment surveillée pour éviter la décongélation et la recongélation des tissus. Le cerveau seulement s’éliminent du congélateur-20 ° C vers le haut à 3 fois comme chaque fois qu’il est touché et gauche dans le cryostat, avec une température plus chaude fluctuant, le tissu dégèle et regèle, causant une gelée comme texture et tissu anormal intégrité10. Par...

Nous présentons ici le protocole pour une nouvelle méthode, que nous appelons Megabrain, mis au point pour cryosection plusieurs rongeurs brains simultanément de méthodes immunohistochimiques en aval. Un Megabrain permet la production de diapositives individuelles contenant des tissus de plusieurs animaux. Cette technique a été optimisée pour des coupes coronales de 9 hémisphères de rat adulte ou 5 adultes cerveau complet, en même temps. Par conséquent, cette technique est plus applicable dans les études immunohistochimiques grand ou autres analyses effectuées sur les tissus cérébraux monté sur glissière d’une importante cohorte d’animaux.
Immunohistochemistry implique l’utilisation d’anticorps spécifiques dirigés contre les protéines d’intérêt de comprendre et de caractériser leur expression et les changements cellulaires dans des tissus spécifiques1,2,3. L’utilisation de l’immunohistochimie est répandue dans la recherche en neurosciences, entre autres disciplines scientifiques, en aidant à la compréhension moléculaire et cellulaire du cerveau4. Des études à grande échelle impliquant de nombreux animaux et sections du cerveau peuvent être les ressources et le temps intensif. Par conséquent, il y a une justification aux multiples facettes du développement de la Megabrain : pour réduire le temps passé à cryosectioning, de montage et de coloration des tissus, lors de l’utilisation par conséquent moins réactifs. En outre, la possibilité de rationaliser le processus et tacher les cerveaux multiples dans le même tour contribue à alléger la variabilité entre les lots, une limitation de l’immunohistochimie3de coloration. En outre, un Megabrain de sectionnement est une alternative de gain de temps au sectionnement des cerveaux de rongeurs congelés individuels et permet une comparaison rapide des tissus entre animaux ou même des groupes de traitement par des techniques de microscopie.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

L’histologie et l’immunohistochimie sont des méthodes de routine d’analyse afin de visualiser l’anatomie microscopique et de localiser des protéines dans les tissus biologiques. En neurosciences, comme une pléthore d’autres domaines scientifiques, ces techniques sont utilisées. Immunohistochemistry peut être fait sur le tissu de diapositives montées ou sections flottantes. Préparation des échantillons montés sur glissière est un processus intensif de temps. Le protocole suivant pour une technique, appelée le Megabrain, réduit le temps nécessaire aux tissus du cerveau cryosection et Mont jusqu'à 90 % en combinant plusieurs cerveaux en un seul bloc congelé. En outre, cette technique réduit la variabilité observée entre tours, dans une vaste étude histochimique de coloration. La technique actuelle a été optimisée pour l’utilisation de tissus cérébraux de rongeurs dans les analyses immunohistochimique en aval ; Toutefois, il peut être appliqué à différents champs scientifiques qui utilisent cryosectioning.

Un résultat positif à cette procédure est le tissu qui se trouve à plat sur la diapositive, sans bulles ni les larmes, dans le sens où ils ont été gelés. Des sections de tissu sont équidistants apart et facilement identifiable en raison du bon placement du cerveau dans l’OPO et bonne notation tel que démontré dans la Figure 1. En supposant que le tissu cérébral ont été recueilli auprès des animaux du même âge, et que le tissu a été corre...

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Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Nous présentons ici un protocole visant à geler et l’article de tissus cérébraux de plusieurs animaux comme une alternative de gagner du temps aux cerveaux unique de transformation. Cela réduit la variabilité coloration en immunohistochimie et réduit d’imagerie et de temps cryosectioning.

Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Cette méthode de gain de temps réduit la variabilité entre les cycles de procédures immunohistochimiques dans les études en neurosciences afin d’optimiser la visualisation de l’anatomie et des protéines et tissus locaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit le temps nécessaire à la cryosection et à la monture des tissus cérébraux en combinant plusieurs cerveaux en un seul bloc gelé. Bien que cette technique soit optimisée pour les sections coronaires du cerveau des rongeurs, elle peut être adaptée aux sections sagittales ou transversales ou à différents types de tissus tels que le muscle ou le foie.Après perfusion transcardique réussie, post-fixer le cerveau des animaux dans un flacon de 25 millilitres de 4% paraformaldéhyde dans PBS pendant 24 heures. Après cela, utilisez des forceps à pointes émoussées pour enlever le cerveau du paraformaldéhyde. Transférez le cerveau dans un flacon avec environ 20 millilitres de solution de saccharose à 30 % dans le SCT.Gardez le cerveau et la solution jusqu’à ce qu’ils descendent au fond du flacon. Ensuite, placez un bécher en verre de 500 millilitres sur un lit de glace sèche dans un seau à glace. Verser ensuite 300 à 400 millilitres d’isopentane dans le bécher.Maintenir l’isopentane entre 45 et 50 degrés Celsius négatifs. Sur le dessus du banc, remplir un moule d’intégration jetable à mi-chemin plein avec la température de coupe optimale ou composé OCT. Utilisez une aiguille pour enlever les bulles d’air du moule.Utilisez les forceps à pointe émoussée pour enlever le premier cerveau de la solution de saccharose. Ensuite, utilisez une nouvelle lame de rasoir pour enlever le cervelet et les ampoules olfactives avant de séparer les hémisphères. Ensuite, donnez au cerveau un système de dénomination numérique.Utilisez des forceps contondants, ramasser le cerveau pour être placé en position deux, et l’orienter avec le côté à couper d’abord face vers le haut. Abaissez le cerveau dans l’OCT et utilisez la pince à épiler pour ajuster sa position jusqu’à ce qu’il reste indépendant. Une modification clé de cette technique est l’espace vide dans la position un.Cet espace est désigné pour permettre une identification facile de l’orientation mégabraïne et donc identifier l’animal associé à chaque cerveau. Après que tous les cerveaux ont été placés dans le moule, ajouter suffisamment d’OCT pour couvrir le sommet du cerveau, puis utiliser une aiguille pour enlever les bulles d’air. Tenez le coin du moule avec des forceps assurant que les forceps ne deviennent pas partiellement submergés dans l’OCT.Ensuite, abaissez le moule dans l’isopentane de sorte que le tiers inférieur du moule est submergé. Après 30 secondes, abaisser le moule entier dans l’isopentane et le libérer des forceps. Après trois minutes, utiliser les forceps pour enlever le moule de l’isopentane.Enveloppez immédiatement le moule et son contenu dans du papier d’aluminium et étiquetez-le de façon appropriée. Transférer la mégabrane dans un congélateur négatif de 20 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Tout d’abord, réglez la température de l’armoire cryostat à 19 degrés Celsius négatifs.Retirer la mégabrane du congélateur et la placer dans le cryostat. Placez ensuite un mandrin et deux pinceaux à pointe mince dans le cryostat. Après cela, étiquetez les diapositives avec le numéro d’identification des mégabrassures et le numéro de diapositives et mentent les glissières sur le chauffe-glissière.Ensuite, déballer le mégabrain et utiliser une lame de rasoir pour couper les coins du moule. Distribuez une fine couche d’OCT sur le mandrin. Placez rapidement le mégabrain sur le mandrin.Après que l’OCT est complètement gelé, appliquez une couche de deux millimètres d’OCT autour des côtés de la mégabrane et laissez-le courir sur les côtés sur le mandrin. Utilisez une lame de rasoir pour enlever tout excès d’OCT sur les côtés et le bas du mandrin. Tout d’abord, placez le mandrin monté avec le mégabrain sur la tête de mandrin du cryostat.Réglez ensuite le cryostat à l’épaisseur désirée. Coupez l’OCT et les tissus au besoin pour atteindre la région du cerveau désirée pour la collecte des tissus. Ensuite, abaissez la plaque anti-roulis jusqu’à ce qu’elle repose sur la scène et tournez la poignée cryostat pour prendre une seule section.Soulevez lentement la plaque anti-roulis, en prenant soin que la section tissulaire n’est pas touchée. Utilisez doucement les pinceaux pour dérouler la section tissulaire jusqu’à ce qu’elle soit couchée à plat. Si nécessaire, maintenez l’OCT à plat à l’aide des pinceaux pour éviter de rouler.Retirez ensuite la glissière du chauffe-glissière et faites planer le côté de l’étiquette de la glissière vers le bas au-dessus de la section mégabraïne et laissez-la coller à la glissière. Appliquez rapidement une goutte de PBS sur la section tissulaire. À l’aide d’un pinceau à pointe fine plongé dans PBS, brossez toutes les bulles dans la section tissulaire et dépliez le tissu de sorte qu’il est couché à plat sur la lame.Enfin, placez la lame sur le chauffe-glissière pour sécher pendant 45 minutes et rangez la glissade à 80 degrés Celsius négatifs. Dans ce protocole, le tissu cérébral de neuf animaux ont été préparés et cryosectionnés simultanément. Après la cryosection, la coloration H&E peut être effectuée pour évaluer la qualité de cryoprotection.Les résultats représentatifs de la molécule ionisée d’adaptateur de fixation de calcium un ou Iba1 soudant des microglies montrent la coloration cohérente entre chaque cerveau d’étude sur un mégabrain simple. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller constamment la température tout en gelant la mégabraïne pour empêcher la fissuration ou la décongélation, puis le regel du tissu qui conduit à l’intégrité anormale des tissus. Il n’est pas conseillé de séparer différents groupes de traitement dans des mégabrassés distincts, car cela peut créer une variance entre les groupes pendant la coloration et réduire les biais et la subjectivité pendant l’imagerie et l’analyse.N’oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que le port du PBE et le travail dans une hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

IRMf simultanées et l&#39;électrophysiologie dans le cerveau de rongeurs

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Recherche

Neurosciences

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

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La culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Simultanée électrophysiologique Enregistrement et micro-injections d&#39;agents inhibiteurs dans le cerveau des rongeurs

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

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Stimulation multimodale automatisée et enregistrement neuronal simultané à partir de plusieurs petits organismes

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...