Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
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Fondi di sostegno di missione PCH supportato la ricerca riferita in questo manoscritto. Gli autori vorrei ringraziare Daniel Griffiths per scattare le immagini utilizzate nelle figure.

La tecnica di Megabrain è stata ottimizzata usando il cervello intero e hemisected da maschio adulto di topi C57Bl65, ratti Sprague-Dawley giovani e ratti Sprague-Dawley adulti che sono stati via con 1x tamponato fosfato salino (PBS) seguita da 4% paraformaldeide6. Risultati simili possono essere realizzati in altri ceppi di topo e di ratto, in entrambi i sessi e a diverse età. Lo studio per generare dati per questo manoscritto usato ratti Sprague-Dawley giovani ed è sta...

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	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

Durante questa procedura dovrebbe essere considerato che la temperatura della Megabrain e i suoi dintorni deve essere costantemente monitorata per evitare lo scongelamento e il ri-congelamento del tessuto. Il cervello può essere rimosso solo dal congelatore a-20 ° C fino a 3 volte come ogni volta che viene toccata e sinistra nel criostato, con una temperatura più calda fluttuante, il tessuto si scongela e si ricongela, causando una gelatina come consistenza e l'integrità di tessuto anormale10....

Qui, presentiamo il protocollo per un metodo novello, che noi chiamiamo Megabrain, sviluppato per donatrici roditore più cervelli contemporaneamente per procedure immunohistochemical a valle. Un Megabrain consente la produzione di singole diapositive che contiene il tessuto da più animali. Questa tecnica è stata ottimizzata per tagliare sezioni coronali da 9 emisferi di ratto adulto, o 5 cervello adulto completo, contemporaneamente. Pertanto, la tecnica è più applicabile in studi immunohistochemical grande o altre analisi fatto sul tessuto cerebrale montata da un grande gruppo degli animali.
Immunohistochemistry implica l'uso di anticorpi specifici diretti contro le proteine di interesse per comprendere e caratterizzare la loro espressione e cambiamenti cellulari nel tessuto specifico1,2,3. L'uso di immunohistochemistry è prevalente in ricerca in neuroscienza, tra le altre discipline scientifiche, aiutando nella comprensione del cervello4cellulare e molecolare. Studi su larga scala che coinvolge molti animali e sezioni del cervello possono essere sia risorse e tempo intensivo. Come tale, c'è un poliedrico razionale dietro lo sviluppo della Megabrain: per ridurre il tempo trascorso cryosectioning, montaggio e la macchiatura del tessuto, durante l'utilizzo di conseguenza meno reattivi. Inoltre, la possibilità di semplificare il processo e macchia più cervelli nello stesso turno aiuta ad alleviare alcuni della variabilità tra lotti, una limitazione di immunohistochemistry3di colorazione. Inoltre, un Megabrain di sezionamento è un'alternativa di risparmio di tempo ai singoli cervelli congelati del roditore di sezionamento e permette per un rapido confronto del tessuto tra animali o anche i gruppi di trattamento mediante tecniche di microscopia.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

Istologia e immunohistochemistry sono metodi di routine di analisi per visualizzare l'anatomia microscopica e localizzare le proteine all'interno dei tessuti biologici. In neuroscienze, così come una pletora di altri campi scientifici, queste tecniche sono utilizzate. Immunohistochemistry può essere fatto su tessuto scivolo montato o sezioni digalleggiante. Preparazione dei campioni montata è un processo intensivo di tempo. Il seguente protocollo per una tecnica, denominata Megabrain, ridotto il tempo necessario al tessuto cerebrale donatrici e Monte fino al 90% combinando più cervelli in un unico blocco congelato. Inoltre, questa tecnica ridotta variabilità visto tra turni, in un grande studio istochimico di colorazione. La tecnica attuale è stata ottimizzata per l'utilizzo di tessuto cerebrale dei roditori nelle analisi immunohistochemical a valle; Tuttavia, può essere applicato a diversi ambiti scientifici che utilizzano cryosectioning.

Un risultato positivo a questa procedura è il tessuto che si trova pianamente sulla diapositiva, senza bolle o lacrime, l'orientamento in cui erano congelati. Sezioni di tessuto sono spaziate uniformemente apart e facilmente identificabili a causa di buon piazzamento del cervello nei PTOM e buona notazione come dimostrato nella Figura 1. Supponendo che il tessuto cerebrale è stato raccolto da animali di età simile, e che il tessuto è stato allineato corre...

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Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Qui, presentiamo un protocollo per congelare e sezione di tessuto cerebrale da più animali come alternativa ad alta produttività per singoli cervelli di elaborazione. Questo riduce la variabilità di colorazione durante immunohistochemistry e imaging e tempo cryosectioning.

Cryosectioning simultanea di più cervelli roditore

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Questo metodo che consente di risparmiare tempo riduce la variabilità tra cicli di procedure immunoistochimiche negli studi di neuroscienze per ottimizzare la visualizzazione dell'anatomia e delle proteine e dei tessuti locali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce il tempo necessario per la criosezione e montare il tessuto cerebrale combinando più cervelli in un unico blocco congelato. Mentre questa tecnica è ottimizzata per sezioni coronali del cervello dei roditori, può essere adattata a sezioni sagittali o trasversali o diversi tipi di tessuti come muscoli o fegato.A seguito di una perfusione trascardica riuscita, post-fissare il cervello degli animali in una fiala da 25 millilitri del 4% di paraformaldeide in PBS per 24 ore. Dopo questo, usa le forcep con punta smussata per rimuovere il cervello dalla paraformaldeide. Trasferire il cervello in una fiala con circa 20 millilitri di soluzione di saccarosio al 30% in TBS.Mantenere il cervello e la soluzione fino a quando non affondano sul fondo del flaconcino. Quindi, metti un bicchiere di vetro da 500 millilitri su un letto di ghiaccio secco in un secchio di ghiaccio. Quindi versare da 300 a 400 millilitri di isopentane nel becher.Mantenere l'isopentane tra -45 e -50 gradi Celsius. Sul piano del banco, riempire uno stampo di incorporamento monouso approssimativamente a metà pieno con temperatura di taglio ottimale o composto OCT. Utilizzare un ago per rimuovere eventuali bolle d'aria dallo stampo.Utilizzare le forcep smussate per rimuovere il primo cervello dalla soluzione di saccarosio. Quindi utilizzare una nuova lama di rasoio per rimuovere il cervelletto e i bulbi olfattivi prima di separare gli emisferi. Quindi, dai al cervello un sistema di denominazione numerica.Usa le forcep smussate, raccogli il cervello per essere posizionato in posizione due e orientalo con il lato da tagliare prima rivolto verso l'alto. Abbassare il cervello nello Strumento di personalizzazione di Office e utilizzare le pinzette per regolarne la posizione fino a quando non si trova in modo indipendente. Una modifica chiave di questa tecnica è lo spazio vuoto in posizione uno.Questo spazio è designato per consentire una facile identificazione dell'orientamento dei megabrain e quindi identificare l'animale associato a ciascun cervello. Dopo che tutti i cervelli sono stati posizionati nello stampo, aggiungere un OCT sufficiente per coprire la parte superiore del cervello, quindi utilizzare un ago per rimuovere eventuali bolle d'aria. Tenere l'angolo dello stampo con le forcep assicurando che le forcep non diventino parzialmente sommerse nello Strumento di personalizzazione di Office.Quindi, abbassare lo stampo nell'isopentane in modo che il terzo inferiore dello stampo sia sommerso. Dopo 30 secondi, abbassare l'intero stampo nell'isopentane e rilasciarlo dalle forcep. Dopo tre minuti, utilizzare le forcep per rimuovere lo stampo dall'isopentane.Avvolgere immediatamente lo stampo e il suo contenuto in un foglio di alluminio ed etichettarlo in modo appropriato. Trasferire il megabrain in un congelatore negativo di 20 gradi Celsius per un minimo di 24 ore. In primo luogo, impostare la temperatura dell'armadio criostato su -19 gradi Celsius.Rimuovere il megabrain dal congelatore e posizionare nel criostato. Quindi posizionare un mandrino e due sottili pennelli con punta nel criostato. Successivamente, etichettare le diapositive con il numero di identificazione del megabrain e il numero di diapositiva e posare le diapositive sullo scaldas vetrino.Quindi, scartare il megabrain e utilizzare una lama di rasoio per tagliare gli angoli dello stampo. Distribuire un sottile strato di OCT sul mandrino. Quindi posizionare rapidamente il megabrain sul mandrino.Dopo che lo Strumento di personalizzazione di Office è completamente congelato, applicare uno strato di due millimetri di OCT intorno ai lati del megabrain e consentirgli di correre lungo i lati sul mandrino. Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere qualsiasi OCT in eccesso dai lati e dal fondo del mandrino. Per prima cosa, posizionare il mandrino montato con il megabrain sulla testa del mandrino del criostato.Quindi impostare il criostato allo spessore desiderato. Tagliare lo PTOM e il tessuto in base alle esigenze per raggiungere la regione cerebrale desiderata per la raccolta dei tessuti. Quindi abbassare la piastra antirollio fino a quando non si appoggia sul palco e ruotare la maniglia del criostato per prendere una singola sezione.Sollevare lentamente la piastra antirollio, facendo attenzione che la sezione tissutale non venga toccata. Utilizzare delicatamente i pennelli per srotolare la sezione del tessuto fino a quando non è piatta. Se necessario, tenere piatto lo Strumento di personalizzazione di Office utilizzando i pennelli per evitare la laminazione.Quindi rimuovere la diapositiva dallo scaldascivole e posizionare il puntatore del mouse sul lato dell'etichetta della diapositiva verso il basso sulla sezione del megabrain e consentirgli di attenersi alla diapositiva. Applicare rapidamente una goccia di PBS alla sezione tissutale. Utilizzando un pennello a punta fine immerso in PBS, spazzolare eventuali bolle nella sezione del tessuto e aprire il tessuto in modo che sia piatto sullo scivolo.Infine, posizionare la diapositiva sullo scaldascivolo per asciugare per 45 minuti e conservare la diapositiva a -80 gradi Celsius. In questo protocollo, il tessuto cerebrale di nove animali è stato preparato e criosezione contemporaneamente. Dopo la criosezione, è possibile effettuare la colorazione H&E per valutare la qualità della crioprotezione.Risultati rappresentativi della molecola di adattatore di legante calcio ionizzato una o colorazione Iba1 di microglia mostrano una colorazione coerente tra ogni cervello di studio su un singolo megabraina. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare costantemente la temperatura congelando il megabrain per evitare crepe o scongelarsi e quindi ricongelare il tessuto che porta a un'integrità anomala del tessuto. Non è consigliabile separare diversi gruppi di trattamento in megabraine separate in quanto ciò può creare varianza tra i gruppi durante la colorazione e ridurre la distorsione e la soggettività durante l'imaging e l'analisi.Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare PBE e lavorare in un cappuccio devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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