Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
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PCH ミッション サポート資金は、本稿で報告された研究をサポートしました。著者は、数字で使用されている画像を撮影のダニエル ・ グリフィスを感謝したいです。

Megabrain 技術は、男性成人 C57Bl6 マウス5、若年ラット、およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 続いて x 1 と transcardially をした大人の Sprague-dawley ラットから hemisected と全体の脳を使用して最適化されています4% パラホルムアルデヒド6。マウスおよびラット、男女や年齢の他の系統と同様の結果を実現できます。この原稿のデータを生成する研究若年ラットを使用...

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	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

それは、融解と再組織の凍結を防ぐために、Megabrain とその周辺の温度を常に監視する必要があります、この手順で考慮必要があります。脳のみ削除できます-20 ° C のフリーザーからに 3 回としてたびにそれに触れると暖かい変動温度、組織と、クリオスタットの左を解凍し、refreezes、テクスチャや異常組織の完全性10のようなゼリーを引き起こしています。したがって、す?...

ここでは、cryosection 複数齧歯動物脳同時に下流の免疫組織化学的手順を開発した Megabrain と呼ばれる手法のプロトコルを提案する.Megabrain は、複数の動物からのティッシュを含んでいる 1 つのスライドの生産が可能です。この手法は、9 の成体ラット半球または 5 の成人における脳からコロナ セクションを同時にカットする最適化されています。したがって、手法は大規模な免疫組織化学的研究や動物の大規模コホートからスライド マウントの脳組織に行う他の分析に最も適切です。
免疫組織化学には理解し、彼らの表情と特定の組織1,2,3の細胞変化を特徴付ける興味の蛋白質に対して指示される抗体の使用が含まれます。免疫組織化学的の使用は神経科学研究では、脳の4の細胞・分子の理解で助ける他の科学分野の間で流行。多くの動物との脳のセクションを含む大規模な研究は、リソースと時間がかかることができます。など、多面的な根拠、Megabrain の開発がある: セクショニング、マウント、およびその結果以下の試薬を使用しながら、組織を染色を過ごした時間を短縮します。さらに、プロセスを合理化し、同じ複数の脳を染色する能力のラウンド バッチ、免疫組織化学3の制限を染色性変動のいくつかを軽減するのに役立ちます。さらに、Megabrain を区分個別冷凍げっ歯類脳を断面に時間節約代替および動物やでも、試験治療グループ間の組織の迅速な比較により顕微鏡検査の技術。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

組織および免疫組織化学は、顕微解剖学を視覚化し、生体組織内の蛋白質を集中解析のルーチンの方法です。他の科学分野の茄多と同様、神経科学、これらのテクニックを使用します。スライド マウント組織または浮遊セクションに対する免疫組織化学を行うことができます。スライド マウントのサンプルを準備して、時間集中的なプロセスです。Megabrain と呼ばれるテクニックの次のプロトコルは、単一の冷凍ブロックに複数の脳を組み合わせることで最大 90 %cryosection とマウントの脳組織へ搬送時間を短縮しました。さらに、この手法は大規模な組織化学的研究でのラウンドを染色の間見られる変動を削減しました。現在のテクニックは、下流の免疫組織化学的解析で齧歯動物の脳組織を使用するために最適化されていますただし、セクショニングを使用する別の科学的なフィールドに適用できます。

このプロシージャに肯定的な結果は、泡や涙、凍結された向きでない、スライドにある組織です。切片は、OCT で脳と図 1に示すよう良い表記の良い配置のため離れてしやすい等間隔です。脳組織は同じような年齢の動物から採取したと、組織は OCT に合っていると仮定すると、スライドの収集のセクションは似たようなコロナの平面は、動物の?...

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Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

ここでは、凍結し、単一脳の処理時間を節約する代わりとして複数の動物から脳組織をセクション プロトコルを提案します。これは免疫組織化学的に染色変動を減少し、時間セクショニングとイメージングを減少します。

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

この時間を節約する方法は、解剖学および局所的なタンパク質および組織の可視化を最適化するために、神経科学研究における免疫組織化学的手順のラウンド間の変動を減少させる。この技術の主な利点は、複数の脳を単一の凍結ブロックに組み合わせることで、凍結切断と脳組織の取り付けにかかる時間を短縮することです。この技術はげっ歯類の脳の冠状動脈セクションに最適化されていますが、矢状または横方向のセクション、または筋肉や肝臓などの異なるタイプの組織に適応することができます。正常な経心面灌流に続いて、24時間PBSで4%パラホルムアルデヒドの25ミリリットルバイアルで動物からの脳を後固定する。この後、パラホルムアルデヒドから脳を取り除くために鈍い先端鉗子を使用してください。TBSで30%スクロース溶液の約20ミリリットルのバイアルに脳を移す。彼らはバイアルの底に沈むまで、脳と解決策を保ちます.次に、アイスバケツのドライアイスのベッドの上に500ミリリットルのガラスビーカーを置きます。その後、ビーカーに300〜400ミリリットルのイポペンタンを注ぎます。マイナス45度とマイナス50°Cの間のイセペンタンを維持します。ベンチ上部で、最適な切断温度またはOCT化合物で、使い捨て埋め込み金型をほぼ半分いっぱいに充填します。針を使用して、金型から気泡を取り除きます。スクロース溶液から最初の脳を取り除くために鈍い先端鉗子を使用してください。その後、半球を分離する前に小脳と嗅球を取り除くために新しいカミソリの刃を使用してください。次に、脳に数値命名システムを与えます。鈍い鉗子を使用し、2番目の位置に置かれる脳を拾い、最初に上向きに切り取られる側でそれを向ける。OCTに脳を下げ、ピンセットを使用して独立して立つまで位置を調整します。この手法の重要な変更は、位置 1 の空白です。この空間は、メガブレインの向きを容易に識別できるように指定されているため、各脳に関連付けられている動物を識別します。すべての脳が金型に配置された後、脳の上部をカバーするのに十分なOCTを追加し、針を使用して気泡を取り除きます。フォースプを使用して金型のコーナーを保持し、フォースが OCT で部分的に水没しないようにします。次に、金型の底部3分の1が水没するように、イソペンタンにモールドを下げます。30秒後、金型全体をイポペンタンに下げ、鉗子から放出します。3分後、鉗子を使用してイポランタンから金型を取り除きます。金型とその内容物を直ちにアルミホイルで包み、適切なラベルを貼ります。メガブレインを最低24時間、マイナス20°Cの冷凍庫に移します。まず、クライオスタットキャビネットの温度をマイナス19°Cに設定します。冷凍庫からメガブレインを取り出し、クライオスタットに入れる。その後、チャックと2つの薄い先端のペイントブラシをクライオスタットに置きます。この後、メガブレイン識別番号とスライド番号でスライドにラベルを付け、スライドウォーマーにスライドを置きます。次に、メガブレインを解き放ち、カミソリの刃を使用してカビの角をカットします。OCTの薄い層をチャックに分配します。その後、すぐにチャックの上にメガブレインを置きます。OCTが完全に凍結した後、メガブレインの側面の周りにOCTの2ミリメートル層を適用し、チャックに側面を実行することができます。カミソリの刃を使用して、チャックの側面と底部から余分なOCTを取り除きます。まず、クライオスタットのチャックヘッドにメガブレインを搭載したチャックを配置します。次に、クライオスタットを希望の厚さに設定します。組織の収集のために所望の脳領域に到達するために必要に応じてOCTと組織をトリミング.その後、ステージ上に置かれるまでアンチロールプレートを下げ、クライオスタットハンドルを回して単一のセクションを取ります。反ロールプレートをゆっくりと持ち上げ、組織部分が触れないように注意してください。塗料ブラシをそっと使って、平らに横たわるまで組織セクションを展開します。必要に応じて、ペイントブラシを使用してOCTフラットを保持し、ローリングを防ぎます。次に、スライドウォーマーからスライドを取り外し、スライドラベルをメガブレインセクションの上に下に置き、スライドに固執できるようにします。迅速に組織のセクションにPBSの滴を適用します。PBSに浸した細かい先端のペイントブラシを使用して、組織セクション内の気泡を磨き、スライド上に平らに横たわっているように組織を展開します。最後に、スライドウォーマーの上にスライドを置いて45分間乾燥させ、マイナス80°Cでスライドを保存します。このプロトコルでは、9匹の動物からの脳組織を準備し、同時に凍結切断した。凍結切除後、H&E染色を行い、凍結保護の品質を評価することができます。イオン化カルシウム結合アダプター分子1またはIba1ミクログリアの染色の代表的な結果は、各研究脳間の一貫した染色を単一のメガブレイン上で示す。この手順を試みる間、異常な組織の完全性につながる組織の割れや解凍を防ぐために、メガブレインを凍結しながら常に温度を監視することを忘れないでください。これは、染色中にグループ間の差異を作成し、イメージングと分析中にバイアスと主観性を減らすことができるので、別々のメガブレインで異なる治療群を分離することはお勧めしません。パラホルムアルデヒドを使用することは非常に危険であり、PBEを着用し、フードで作業するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

齧歯類の脳における同時fMRIと電気生理学

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

老化脳の収集、処理、特徴付けのためのアッビアテグラッソブレインバンクプロトコル

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

マウス脳のフリーフローティング免疫染色

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

複数の小生物からの自動マルチモーダル刺激と同時神経記録

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...