Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

PCH oppdrag Support fond støtte forskning rapportert i dette manuskriptet. Forfatterne vil gjerne takke Daniel Griffiths for å ta bilder som brukes i tallene.

Megabrain teknikken er optimalisert ved hjelp av hele og hemisected hjernen fra mannlig voksen C57Bl6 mus5, juvenile Sprague-Dawley rotter og voksen Sprague-Dawley rotter som var transcardially parfyme med 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) fulgt med 4% paraformaldehyde6. Lignende resultater kan oppnås i andre stammer av mus og rotten, i begge kjønn og på ulike aldersgrupper. Studien å generere data for dette manuskriptet brukt juvenile Sprague-Dawley rotter og ble godkje...

<ol>
	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

Det bør vurderes under denne prosedyren at temperaturen på Megabrain og omegn må overvåkes kontinuerlig for å hindre tining og re frysing av vev. Hjernen kan bare fjernes fra 20 ° C fryseren opp til 3 ganger som hver gang det rørte og venstre i kryostaten, med en varmere varierende temperatur, vevet thaws og refreezes, forårsaker en gelé som tekstur og unormale vevet integritet10. Derfor er det optimale å kutte Megabrain samtidig.
Vev fiksering og cryoprotecti...

Her presenterer vi protokoll for en ny metode, som vi kaller Megabrain, utviklet for å cryosection flere gnager hjerner samtidig for nedstrøms immunohistochemical prosedyrer. En Megabrain kan for produksjon av enkeltlysbilder som inneholder vev fra flere dyr. Denne teknikken er blitt optimert for å kutte framskaffet 9 voksen rotte halvkuler eller 5 voksne full hjernen, samtidig. Derfor er teknikken mest aktuelt i store immunohistochemical studier eller andre analyser gjort på lysbilde montert hjernevevet fra en stor kohort av dyr.
Immunohistochemistry innebærer bruk av spesifikke antistoffer rettet mot proteiner av interesse å forstå og karakterisere deres uttrykk og mobilnettet endringer i bestemte vev1,2,3. Bruk av immunohistochemistry er utbredt i nevrovitenskap forskning, blant andre vitenskapelige disipliner, hjelpe i mobilnettet og molekylære forståelsen av hjernen4. Store studier som involverer mange dyr og hjernen delene kan være både ressurser og tid intensiv. Som sådan, det er en mangefasettert begrunnelsen bak utviklingen av Megabrain: å redusere tid brukt og kryosnitt, montering og flekker vev, mens du bruker derfor mindre reagenser. Dessuten mulighet til å strømlinjeforme prosessen og flekken flere hjerner i samme runde bidrar til å lindre noen av variasjon mellom flekker bunker, en begrensning av immunohistochemistry3. I tillegg snitting en Megabrain er en tidsbesparende alternativ til snitting personlige frosne gnager hjerner og gir mulighet for rask sammenligning av vev mellom dyr eller selv behandlingsgrupper av mikroskopi teknikker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

Histologi og immunohistochemistry er rutinemessig analysemetoder å visualisere mikroskopiske anatomi og lokalisere proteiner i biologisk vev. I nevrovitenskap, samt en mengde andre vitenskapelige områder brukes disse teknikkene. Immunohistochemistry kan gjøres på lysbilde montert vev eller frittflytende deler. Forbereder lysbilde montert prøver er en tid intensiv prosess. Følgende protokollen for et teknikk, kalt Megabrain, redusert tiden det tar å cryosection og mount hjernevev med opptil 90% ved å kombinere flere hjerner i en enkelt frosne blokk. Videre, denne teknikken redusert variasjon sett mellom flekker runder, i en stor histochemical studie. Gjeldende teknikken er optimalisert for bruk av gnager hjernevev i nedstrøms immunohistochemical analyser; men kan det brukes til forskjellige vitenskapelige felt som bruker og kryosnitt.

Et positivt sluttresultat denne prosedyren er vev som ligger flatt på lysbildet uten bobler eller tårer, i retning der de ble frosset. Vev deler er avstand fra hverandre og lett identifiserbare på grunn av god plassering av hjernen i Tilpasningsverktøy for Office og god notasjon som vist i figur 1. Forutsatt at hjernevev ble samlet inn fra dyr av samme alder, og at vevet ble riktig justert i Tilpasningsverktøy for Office, skal inndelinger samlet på et l...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Her presenterer vi en protokoll for å fryse og delen hjernevevet fra flere dyr som en tidsbesparende alternativ til behandling enkelt hjerner. Dette reduserer flekker variasjon i immunohistochemistry og reduserer tid og kryosnitt og bildebehandling.

Samtidig og kryosnitt flere gnager hjerner

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Denne tidsbesparende metoden reduserer variasjon mellom runder med immunohistokjemiske prosedyrer i nevrovitenskapsstudier for å optimalisere visualiseringen av anatomi og lokale proteiner og vev. Den største fordelen med denne teknikken er at det reduserer tiden det tar å kryosection og montere hjernevev ved å kombinere flere hjerner i en enkelt frossen blokk. Mens denne teknikken er optimalisert for koronale deler av gnagerhjerner, kan den tilpasses sagittal eller tverrgående seksjoner eller forskjellige typer vev som muskel eller lever.Etter vellykket transcardial perfusjon, post-fikse hjernen fra dyrene i en 25 milliliter hetteglass med 4% paraformaldehyd i PBS i 24 timer. Etter dette, bruk stumpe spisse tang for å fjerne hjernen fra paraformaldehyd. Overfør hjernen til et hetteglass med ca. 20 milliliter med 30 % sukroseoppløsning i TBS.Hold hjernen og løsningen til de synker til bunnen av hetteglasset. Deretter legger du et 500 milliliter glassbeger på en seng med tørris i en isbøtte. Hell deretter 300 til 400 milliliter isopentan i begeret.Opprettholde isopentane mellom negative 45 og negative 50 grader Celsius. På benketoppen fyller du en engangsinnbyggingsform omtrent halvveis full med Optimal skjæretemperatur eller OCT-forbindelse. Bruk en nål til å fjerne eventuelle luftbobler fra formen.Bruk de stumpe spisse tangene til å fjerne den første hjernen fra sukroseløsningen. Bruk deretter et nytt barberblad for å fjerne lillehjernen og olfaktoriske pærer før du skiller halvkulene. Deretter gir hjernen et numerisk navnesystem.Bruk stumpe tang, plukk opp hjernen som skal plasseres i posisjon to, og orientere den med siden som skal kuttes først vendt oppover. Senk hjernen ned i OCT og bruk pinsettene til å justere posisjonen til den står uavhengig. En viktig endring av denne teknikken er det tomme rommet i posisjon en.Dette rommet er utpekt for å tillate enkel identifisering av megabrain orientering og derfor identifisere dyret forbundet med hver hjerne. Etter at alle hjernene er plassert i formen, legg til tilstrekkelig OCT for å dekke toppen av hjernen, og bruk deretter en nål for å fjerne eventuelle luftbobler. Hold hjørnet av formen med tang som sikrer at tangene ikke blir delvis nedsenket i OKTOBER.Senk deretter formen i isopentanen slik at den nederste tredjedelen av formen er nedsenket. Etter 30 sekunder senker du hele formen i isopentanen og frigjør den fra tangene. Etter tre minutter, bruk tangen til å fjerne formen fra isopentanen.Umiddelbart vikle formen og innholdet i aluminiumsfolie og merk den riktig. Overfør megabrainen til en negativ 20 grader Celsius fryser i minst 24 timer. Først setter du temperaturen på kryostatskapet til negative 19 grader Celsius.Fjern megabrainen fra fryseren og legg den i kryostaten. Legg deretter en chuck og to tynne spisse pensler i kryostaten. Etter dette merker du lysbildene med megabrainidentifikasjonsnummeret og lysbildenummeret og legger lysbildene på lysbildet varmere.Deretter pakke megabrain og bruke et barberblad for å kutte hjørnene av formen. Dispenser et tynt lag med OCT på chucken. Deretter plasserer du raskt megabrainen på chucken.Etter at OCT er helt frosset, påfør et to millimeter lag med OCT rundt sidene av megabrainen og la den kjøre ned sidene på chucken. Bruk et barberblad til å fjerne overflødig OCT fra sidene og bunnen av chucken. Plasser først chucken montert med megabrain på chuckhodet på kryostaten.Sett deretter kryostaten til ønsket tykkelse. Trim OCT og vev etter behov for å nå ønsket hjerneregion for vevsamling. Senk deretter anti-roll platen til den hviler på scenen og vri kryostathåndtaket for å ta en enkelt seksjon.Løft langsomt av anti-roll platen, vær forsiktig med at vevseksjonen ikke berøres. Bruk forsiktig penselen til å rulle ut vevseksjonen til den ligger flatt. Hold om nødvendig OCT flatt med penselen for å unngå rulling.Fjern deretter lysbildet fra glidevarmeren og hold skyveetiketten side ned over megabraindelen og la den holde seg til lysbildet. Bruk raskt en dråpe PBS på vevsseksjonen. Ved hjelp av en fin tippet pensel dyppet i PBS, børst ut eventuelle bobler i vevsdelen og brette ut vevet slik at det ligger flatt på lysbildet.Til slutt plasserer du lysbildet på lysbildet varmere for å tørke i 45 minutter og lagre lysbildet på negative 80 grader Celsius. I denne protokollen ble hjernevev fra ni dyr forberedt og kryoseksjonert samtidig. Etter kryoseksjon kan H&E-farging utføres for å vurdere kryobeskyttelseskvaliteten.Representative resultater av ionisert kalsiumbindingsadaptermolekyl ett eller Iba1-farging av microglia viser konsistent farging mellom hver studiehjerne på en enkelt megabrain. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å kontinuerlig overvåke temperaturen mens du fryser megabrain for å forhindre sprekker eller tining og deretter fryse vevet som fører til unormal vevsintegritet. Det anbefales ikke å skille ulike behandlingsgrupper i separate megabrainer, da dette kan skape varians mellom grupper under farging og redusere skjevhet og subjektivitet under avbildning og analyse.Ikke glem at det å arbeide med paraformaldehyd kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som bruk av PBE og arbeid i hette bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo dyrking av Whole, Utviklingsland Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Electroencephalography, Real-time Måling av laktat Konsentrasjon og Optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Samtidig Elektro Opptak og Micro-injeksjoner av hemmende midler i gnager Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolasjon, Kultur og langsiktig vedlikehold av Primary mesencefalisk dopaminerge nevroner Fra Embryonic Gnagere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplantasjon av Interneuron forløpere til tidlig Postnatal musen hjerner

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolsk analyse av Drosophila melanogaster Larval og voksen hjerner

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for innsamling, behandling og karakterisering av aldrende hjerner

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Frittflytende immunostaining av musehjerner

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Automatisert multimodal stimulering og samtidig nevronopptak fra flere små organismer

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...