Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
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Fundos de apoio de missão de PCH com suporte a pesquisa relatada neste manuscrito. Os autores gostaria de agradecer Daniel Griffiths as imagens usadas nas figuras.

A técnica de Megabrain foi otimizada usando o cérebro todo e hemisected de C57Bl6 ratos adultos machos5, ratos Sprague-Dawley jovens e adultos ratos Sprague Dawley que foram perfundido com solução salina tamponada fosfato (PBS) seguida de 1x de transcardially por de paraformaldeído 4%6. Resultados semelhantes podem ser realizados em outras cepas de camundongo e rato, em ambos os sexos e de diferentes faixas etárias. O estudo para gerar dados para este manuscrito usado...

<ol>
	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

É preciso considerar durante este procedimento que a temperatura da Megabrain e seus arredores deve ser constantemente monitorada para evitar descongelar e recongelar do tecido. O cérebro só pode ser removido do congelador-20 ° C acima de 3 vezes como cada vez é tocado e esquerda no criostato, com uma temperatura mais quente flutuante, o tecido derrete e refreezes, causando uma geleia como textura e tecido anormal integridade10. Portanto, é ideal para cortar o Megabrain tudo de uma vez.
...

Aqui, apresentamos o protocolo para um método novo, que chamamos de Megabrain, desenvolvido para cryosection vários roedores cérebros simultaneamente para procedimentos de imuno-histoquímica a jusante. Um Megabrain permite a produção de slides único contendo tecido de vários animais. Esta técnica foi otimizada para corte coronais seções de 9 hemisférios do rato adulto, ou 5 cérebros completo adultos, simultaneamente. Portanto, a técnica é mais aplicável em estudos imuno-histoquímicos grandes ou outras análises feitos no tecido cerebral slide-montado de uma grande coorte de animais.
Imuno-histoquímica envolve o uso de anticorpos específicos dirigidos contra proteínas de interesse para compreender e caracterizar a sua expressão e as mudanças celulares em tecido específico1,2,3. O uso de imuno-histoquímica é prevalente em pesquisas da neurociência, entre outras disciplinas científicas, auxiliando na compreensão do cérebro4celular e molecular. Estudos em grande escala envolvendo muitos animais e seções do cérebro podem ser tanto recurso e tempo intensivo. Como tal, há uma multifacetada lógica por trás do desenvolvimento da Megabrain: reduzir o tempo gasto cryosectioning, montagem e manchando o tecido, enquanto estiver usando, consequentemente, menos reagentes. Além disso, a capacidade de agilizar o processo e manchar o cérebro múltiplas na mesma rodada ajuda a aliviar um pouco a variabilidade entre lotes, uma limitação de imuno-histoquímica3a coloração. Além disso, um Megabrain de corte é uma alternativa de economia de tempo para secionar cérebros de roedores congelados individuais e permite a comparação rápida de tecido entre animais ou até mesmo grupos de tratamento por técnicas de microscopia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

Histologia e imunohistoquímica são métodos de rotina de análise para visualizar a anatomia microscópica e localizar as proteínas dentro de tecidos biológicos. Em neurociência, bem como uma infinidade de outros campos científicos, estas técnicas são utilizadas. Imuno-histoquímica pode ser feito em tecido de slide montado ou seções flutuantes. Preparação de amostras de slides montados é um processo intensivo. O seguinte protocolo para uma técnica, chamada de Megabrain, reduziu o tempo levado para cryosection e montagem de tecido cerebral em até 90% combinando vários cérebros em um único bloco congelado. Além disso, esta técnica reduzida variabilidade vista entre rodadas, em um grande estudo histoquímico de coloração. A técnica atual foi otimizada para o uso de tecido cerebral de roedores em análises imuno-histoquímica a jusante; no entanto, pode ser aplicado a diferentes áreas científicas que usam cryosectioning.

Um resultado final positivo para este procedimento é um tecido que se encontra no slide, sem bolhas ou lágrimas, na orientação em que estavam congelados. Seções do tecido são espaçadas separados e facilmente identificável devido a boa colocação do cérebro na OCT e boa notação como demonstrado na Figura 1. Supondo que o tecido cerebral foi coletado de animais de idade semelhante, e que o tecido foi devidamente alinhado na OCT, seções coletadas ...

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Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.

Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Este método de economia de tempo reduz a variabilidade entre rodadas de procedimentos imunohistoquímicos em estudos de neurociência para otimizar a visualização da anatomia e proteínas e tecidos locais. A principal vantagem dessa técnica é que ela reduz o tempo necessário para criosecção e montagem de tecido cerebral, combinando múltiplos cérebros em um único bloco congelado. Embora esta técnica seja otimizada para seções coronais de cérebros de roedores, ela pode ser adaptada a seções sagitas ou transversais ou diferentes tipos de tecidos, como músculo ou fígado.Após a perfusão transcárquia bem sucedida, pós-fixar os cérebros dos animais em um frasco de 25 mililitros de 4% de paraformaldeído na PBS por 24 horas. Depois disso, use fórceps de ponta sem corte para remover os cérebros do paraformaldeído. Transfira o cérebro para um frasco com aproximadamente 20 mililitros de solução de 30% de sacarose em TBS.Mantenha os cérebros e a solução até que eles afundem no fundo do frasco. Em seguida, coloque um copo de vidro de 500 mililitros em uma cama de gelo seco em um balde de gelo. Em seguida, despeje 300 a 400 mililitros de isopentane no béquer.Mantenha a isopentane entre 45 negativos e 50 graus Celsius negativos. Na parte superior do banco, encha um molde descartável de incorporação aproximadamente meio cheio com temperatura de corte ideal ou composto OCT. Use uma agulha para remover quaisquer bolhas de ar do molde.Use os fórceps de ponta para remover o primeiro cérebro da solução de sacarose. Em seguida, use uma nova lâmina de barbear para remover o cerebelo e lâmpadas olfativas antes de separar os hemisférios. Em seguida, dê ao cérebro um sistema numérico de nomeação.Use fórceps contundentes, pegue o cérebro para ser colocado na posição dois, e oriente-o com o lado a ser cortado primeiro voltado para cima. Abaixe o cérebro para dentro do OCT e use a pinça para ajustar sua posição até que fique independente. Uma modificação fundamental desta técnica é o espaço em branco na posição um.Este espaço é designado para permitir fácil identificação da orientação do megacérebro e, portanto, identificar o animal associado a cada cérebro. Depois de todos os cérebros terem sido posicionados no molde, adicione OCT suficiente para cobrir os topos do cérebro, em seguida, use uma agulha para remover quaisquer bolhas de ar. Segure o canto do molde com fórceps garantindo que os fórceps não fiquem parcialmente submersos no OCT.Em seguida, abaixe o molde para dentro da isopia para que o terço inferior do molde fique submerso. Após 30 segundos, abaixe todo o molde na isopentane e solte-o dos fórceps. Após três minutos, use os fórceps para remover o molde da isopentane.Enrole imediatamente o molde e seu conteúdo em papel alumínio e rotule-o adequadamente. Transfira o megacérebro para um congelador negativo de 20 graus Celsius por um mínimo de 24 horas. Primeiro, coloque a temperatura do armário criostat para 19 graus Celsius negativo.Retire o megacérebro do congelador e coloque-o no criostat. Em seguida, coloque um mandril e dois pincéis finos no criostat. Depois disso, rotule os slides com o número de identificação do megacérebro e o número do slide e coloque os slides no aquecedor de slides.Em seguida, desembrulhe o megacérebro e use uma lâmina de barbear para cortar os cantos do molde. Distribua uma fina camada de OCT no mandril. Em seguida, rapidamente colocar o megacérebro no mandril.Depois que o OCT estiver completamente congelado, aplique uma camada de dois milímetros de OCT ao redor dos lados do megacérebro e deixe que ele corra pelos lados para o mandril. Use uma lâmina de barbear para remover qualquer excesso de OCT dos lados e parte inferior do mandril. Primeiro, posicione o mandril montado com o megacérebro na cabeça do criostat.Em seguida, coloque o criostat para a espessura desejada. Corte o OCT e o tecido conforme necessário para chegar à região cerebral desejada para coleta de tecidos. Em seguida, abaixe a placa anti-rolo até que ela repouse no palco e gire a alça criostat para tomar uma única seção.Retire lentamente a placa anti-rolo, tomando cuidado para que a seção do tecido não seja tocada. Use delicadamente as pincéis para desenrolar a seção de tecido até que esteja plana. Se necessário, segure o oct flat usando as pincéis para evitar o rolamento.Em seguida, remova o slide do aquecedor de slides e passe o lado da etiqueta de slides para baixo sobre a seção megacérebro e deixe-o grudar no slide. Aplique rapidamente uma gota de PBS na seção tecidual. Usando um pincel fino mergulhado na PBS, escove todas as bolhas na seção tecidual e desdobre o tecido para que ele fique deitado no escorregador.Por fim, coloque o slide no aquecedor para secar por 45 minutos e armazene o slide a 80 graus Celsius negativo. Neste protocolo, tecidos cerebrais de nove animais foram preparados e criosectionados simultaneamente. Após a crioseção, a coloração de H&E pode ser realizada para avaliar a qualidade da crioproteção.Resultados representativos da molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada uma ou Iba1 coloração de microglia mostram coloração consistente entre cada cérebro de estudo em um único megacérebro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar constantemente a temperatura enquanto congela o megacérebro para evitar rachaduras ou descongelamento e, em seguida, recongelamento do tecido que leva à integridade anormal do tecido. Não é aconselhável segregar diferentes grupos de tratamento em megacérebros separados, pois isso pode criar variância entre os grupos durante a coloração e reduzir o viés e a subjetividade durante a imagem e análise.Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como usar PBE e trabalhar em um capuz devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

FMRI simultânea e Eletrofisiologia no cérebro de roedores

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Neurociência

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Protocolo do Banco Cerebral Abbiategrasso para coleta, processamento e caracterização de cérebros envelhecidos

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...