Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

Фонды поддержки миссии PCH поддерживает исследования, о которых сообщалось в этой рукописи. Авторы хотели бы поблагодарить Даниэль Гриффитс нашли изображения, используемые в цифрах.

Megabrain техника была оптимизирована с помощью состава и hemisected мозги от мужчины взрослых мышей C57Bl65, несовершеннолетних крысах Sprague-Dawley и взрослых крыс Sprague-Dawley, которые были transcardially, увлажненную с 1 x фосфатный буфер (PBS) после параформальдегида 4%6. Аналогичные резул...

<ol>
	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

Во время этой процедуры следует рассматривать, что температура Megabrain и его окрестностях должен постоянно контролироваться предотвратить Размораживание и повторное замораживание ткани. Мозг можно только удалить из морозильной камеры-20 ° C до до 3 раза как каждый раз, когда он коснулся и ...

Здесь мы представляем протокол для метода роман, который мы называем Megabrain, разработан для cryosection, несколько грызунов мозги одновременно течению иммуногистохимических процедур. Megabrain позволяет для производства одного слайдов, содержащих ткани от нескольких животных. Эта техника была оптимизирована для вырезать корональных разделы из 9 взрослых крыс полушарий, или 5 взрослых полное мозги, одновременно. Таким образом методика является наиболее применимым в больших иммуногистохимические исследования или другие анализы, сделали на ткани головного мозга, слайд установлен с большой когорты животных.
Иммуногистохимия предполагает использование специфических антител, направленные против протеинов интереса для понимания и характеризуют их выражения и клеточные изменения в конкретных тканей1,2,3. Использование иммуногистохимия преобладает в неврологии исследований, среди других научных дисциплин, пособничество в клеточном и молекулярном понимания мозга4. Крупномасштабные исследования, с участием многих животных и секции мозга может быть как ресурсов, так и во время интенсивного. Таким образом, является многогранной обоснование разработки Megabrain: сократить время провел cryosectioning, монтаж и окрашивание ткани, а следовательно с использованием менее реагентов. Кроме того возможность рационализировать процесс и пятно несколько мозги в том же раунде помогает облегчить некоторые из изменчивость между пятнать пакетов, ограничение иммуногистохимия3. Кроме того секционирование Megabrain является экономия времени альтернативой секционирование отдельных замороженных грызунов мозги и позволяет для быстрого сравнения ткани между животных или даже группы лечения методами микроскопии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

Обычные методы анализа для визуализации микроскопической анатомии и Локализация белков в биологической ткани гистологии и иммуногистохимии. В неврологии, а также множество других научных областях используются эти методы. Иммуногистохимия может быть сделано на слайд монтируется ткани или свободно плавающего секций. Подготовка образцов слайда монтируется это время интенсивного процесса. Следующий протокол для метод, называемый Megabrain, сократить время, необходимое для cryosection и горе ткани мозга до 90% путем объединения нескольких мозги в единый блок замороженные. Кроме того этот метод снижение изменчивости между пятнать раундов, в большой гистохимических исследований. Текущий метод был оптимизирован для использования грызунов мозговой ткани в течению Иммуногистохимический анализ; Однако она может применяться в различных научных областях, использующих cryosectioning.

Положительный конечный результат этой процедуры является ткань, которая лежит плашмя на слайде, без пузырей или слезы, в ориентации, в котором они были заморожены. Разделах ткани равномерно распределены отдельно и легко идентифицировать благодаря хорошее размещение ...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Здесь мы представляем протокол к замораживанию и раздел мозговой ткани из нескольких животных как экономия времени альтернатива для обработки одного мозги. Это уменьшает окрашивание изменчивость во время иммуногистохимии и уменьшает время cryosectioning и томографии.

Одновременно Cryosectioning нескольких грызунов мозги

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Этот метод экономии времени снижает изменчивость между раундами иммуноистохимических процедур в нейробиологии исследований для оптимизации визуализации анатомии и местных белков и тканей. Основным преимуществом этого метода является то, что он сокращает время, затязаемое на криозирование и крепление ткани мозга путем объединения нескольких мозгов в один замороженный блок. Хотя этот метод оптимизирован для корональных секций мозга грызунов, он может быть адаптирован к sagittal или поперечных секций или различных типов тканей, таких как мышцы или печень.После успешной перфузии транскардиального, после фиксации мозга животных в 25 миллилитров флакон 4%paraformaldehyde в PBS в течение 24 часов. После этого используйте тупые наконечником типсы, чтобы удалить мозги из параформальдегида. Перенесите мозг на флакон с примерно 20 миллилитров 30% раствора сахарозы в TBS.Держите мозги и раствор, пока они не опускаются на дно флакона. Затем поместите стеклянный стакан 500 миллилитров на кровать сухого льда в ведро со льдом. Затем залить от 300 до 400 миллилитров изопентанов в стакан.Поддерживайте изопентан между отрицательными 45 и отрицательными 50 градусов по Цельсию. На верхней скамейке, заполнить одноразовые встраивания формы примерно на полпути полный с оптимальной температурой резки или OCT соединения. Используйте иглу, чтобы удалить любые пузырьки воздуха из формы.Используйте тупые наконечником типсы, чтобы удалить первый мозг из раствора сахарозы. Затем используйте новое лезвие бритвы, чтобы удалить мозжечок и обонятельные луковицы перед разделением полушарий. Далее, дайте мозгу числовую систему именования.Используйте тупые типсы, забрать мозг, чтобы быть помещены в положение два, и сориентировать его со стороны, чтобы быть сокращены сначала лицом вверх. Опустите мозг в OCT и используйте пинцет, чтобы настроить свое положение, пока он не стоит самостоятельно. Ключевой модификацией этого метода является пустое пространство в позиции 1.Это пространство предназначено для легкой идентификации мегабрейна ориентации и, следовательно, определить животное, связанное с каждым мозгом. После того, как все мозги были расположены в форме, добавить достаточно OCT для покрытия верхней части мозга, а затем использовать иглу, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Держите угол формы с типсами, чтобы типсы не были частично погружены в ОКТ.Затем опустите плесень в изопентан так, чтобы нижняя треть формы была погружена в воду. Через 30 секунд опустите всю плесень в изопентан и отпустите ее из типсов. Через три минуты используйте типсы, чтобы удалить плесень из изопентан.Немедленно оберните форму и ее содержимое в алюминиевую фольгу и этикетки его соответствующим образом. Перенесите мегабран в морозильную камеру с отрицательным 20 градусов по Цельсию в течение как минимум 24 часов. Во-первых, установите температуру криостата до минус 19 градусов по Цельсию.Удалите мегабран из морозильной камеры и поместите его в криостат. Затем поместите патрон и две тонкие наконечником кисти в криостат. После этого наклеьте ярлык слайдов с идентификационный номер мегабрейна и номер слайда и положите слайды на слайд теплее.Далее, развернуть мегабран и использовать лезвие бритвы, чтобы сократить углы формы. Выпределите тонкий слой OCT на патрон. Затем быстро поместите мегабран на патрон.После того, как OCT полностью заморожен, нанесите двухмиллиметровый слой OCT по бокам мегабрейна и дайте ему бежать вниз по бокам на патрон. Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить излишки OCT со стороны и нижней части патрона. Во-первых, положение патрон установлен с мегабраном на чак голову криостата.Затем установите криостат до нужной толщины. Обрезать OCT и ткани по мере необходимости для достижения желаемой области мозга для сбора тканей. Затем опустите анти-ролл пластины, пока он не лежит на сцене и включите ручку криостата принять одну секцию.Медленно смахив противокатаную пластину, будьте осторожны, чтобы секция ткани не коснулась. Аккуратно используйте кисти, чтобы развернуть секцию ткани, пока она не лежит ровно. При необходимости удерживайте ОКТ квартиру с помощью кистей для предотвращения прокатки.Затем удалите слайд с слайда теплее и наведите курсор на сторону слайда вниз по разделу мегабрейна и дайте ему прилипнуть к слайду. Быстро нанесите каплю PBS на секцию ткани. Используя тонкую наконечником кисть, смоченной в PBS, кисть из любых пузырьков в разделе ткани и разворачивать ткани, чтобы он лежал плашмя на слайде.Наконец, поместите слайд на слайде теплее, чтобы высохнуть в течение 45 минут и хранить слайд при отрицательном 80 градусов по Цельсию. В этом протоколе, ткани мозга от девяти животных были подготовлены и криозекции одновременно. После криозирования, Н И Е окрашивание может быть проведено для оценки качества криопротекторной.Репрезентативные результаты ионизированной молекулы адаптера связывания кальция один или Iba1 окрашивание микроглии показывают последовательное окрашивание между каждым исследованием мозга на одном мегабране. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы постоянно контролировать температуру при замораживании мегабрейна, чтобы предотвратить растрескивание или оттаивание, а затем заморозить ткани, что приводит к ненормальной целостности тканей. Не рекомендуется сегрегировать различные группы лечения в отдельные мегабраны, поскольку это может создать дисперсию между группами во время окрашивания и уменьшить предвзятость и субъективность во время визуализации и анализа.Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как ношение PBE и работа в капюшоне, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Одновременное МРТ и электрофизиологии в мозг грызунов

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Экс естественных Культивирование полного Разработка Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Одновременное Электрофизиологические Запись и Micro-инъекции агенты, ингибирующие в мозге грызунов

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Изоляция, культуры и долгосрочного поддержания первичного теменной дофаминергических нейронов из эмбриональных грызунов Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic трансплантация межнейронного прекурсоров в раннем постнатальном мыши мозги

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Метаболический Анализ Drosophila melanogaster Larval и взрослых мозги

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Abbiategrasso Мозг Банк Протокол для сбора, обработки и характеристики старения мозга

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Свободно плавающее иммуноокрашание мозга мыши

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Автоматизированная мультимодальная стимуляция и одновременная запись нейронов от нескольких мелких организмов

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...