Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
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Fondos de apoyo de la misión de PCH apoyó la investigación en este manuscrito. Los autores desean agradecer a Daniel Griffiths por tomar las imágenes utilizadas en las figuras.

Se ha optimizado la técnica Megabrain con todo y hemiseccionada cerebros de varones adultos de ratones C57Bl65, ratas Sprague-Dawley juvenil y ratas Sprague-Dawley adultas que fueron perfundido con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) seguido de transcardially de paraformaldehído al 4%6. Resultados similares se pueden lograr en otras cepas de ratón y rata, en ambos sexos y diferentes edades. El estudio para generar datos para este manuscrito utilizado ratas Sprague-Dawley...

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	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

Durante este procedimiento, debe considerar que la temperatura de lo Megabrain y sus alrededores debe ser constantemente monitoreada para evitar descongelar y volver a congelar el tejido. El cerebro puede sólo retirarse del congelador de-20 ° C hasta a 3 veces cada vez que se toca y de izquierda en el criostato, con una temperatura fluctuante más cálida, el tejido se descongela y refreezes, causando una jalea como textura y tejido anormal integridad10. Por lo tanto, es óptimo para cortar el M...

Aquí, presentamos el protocolo para un nuevo método, que llamamos Megabrain, convertido a criosección roedor múltiples cerebros al mismo tiempo para los procedimientos de inmunohistoquímica aguas abajo. Un Megabrain permite la producción de diapositivas individuales que contienen tejido de múltiples animales. Esta técnica ha sido optimizada para cortar secciones coronales de hemisferios de rata adulta 9 o 5 cerebros completos adulto, al mismo tiempo. Por lo tanto, la técnica es más aplicable en los estudios de immunohistochemical grandes o en otros análisis realizados en tejido de cerebro montada diapositiva de una cohorte grande de animales.
Immunohistochemistry implica el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra proteínas de interés para entender y caracterizar su expresión y cambios celulares en el tejido específico1,2,3. El uso de la inmunohistoquímica es frecuente en la investigación de la neurociencia, entre otras disciplinas científicas, ayudando en la comprensión celular y molecular del cerebro4. Estudios a gran escala con muchos animales y secciones del cerebro pueden ser intensivo de tiempo y recursos. Como tal, existe una razón multifacético detrás del desarrollo de lo Megabrain: reducir el tiempo dedicado cryosectioning, montaje y tinción de tejidos, mientras que, en consecuencia, menos reactivos. Además, la capacidad de agilizar el proceso y varios cerebros en el mismo la mancha redonda ayuda a aliviar parte de la variabilidad entre lotes, una limitación de inmunohistoquímica3la coloración. Además, seccionar un Megabrain es una alternativa de ahorro de tiempo al seccionamiento cerebros de roedores congelados individuales y permite la comparación rápida de tejido entre animales o incluso grupos de tratamiento por técnicas de microscopía.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

Histología e inmunohistoquímica son métodos de rutina de análisis para visualizar la anatomía microscópica y localizar proteínas en tejido biológico. En neurociencia, así como una plétora de otros campos científicos, se utilizan estas técnicas. Inmunohistoquímica puede hacerse en tejido deslizante montado o secciones flotan libremente. Preparación de muestras de diapositivas es un proceso intensivo de tiempo. El siguiente protocolo para una técnica, llamada el Megabrain, reduce el tiempo necesario para montaje y criosección tejido cerebral hasta un 90% mediante la combinación de varios cerebros en un solo bloque congelado. Además, esta técnica reduce la variabilidad entre rondas, en un gran estudio histoquímico de la coloración. La técnica actual se ha optimizado para el uso de tejido cerebral de roedor en el análisis de immunohistochemical aguas abajo; sin embargo, puede aplicarse a distintos campos científicos que utilizan cryosectioning.

Un resultado positivo para este procedimiento es tejido que se encuentra en la diapositiva, sin burbujas ni lágrimas, en la orientación en que fueron congelados. Las secciones de tejido son uniformemente aparte y fácilmente identificable debido a la buena colocación del cerebro en el OCT y la notación buena como se demuestra en la figura 1. Asumiendo que el tejido cerebral fue recogido de animales de una edad similar, y que el tejido fue alineado en los ...

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Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Aquí, presentamos un protocolo de congelación y sección de tejido cerebral de varios animales como una alternativa de ahorro de tiempo a procesar solo cerebros. Esto reduce la variabilidad de coloración durante la inmunohistoquímica y reduce la proyección de imagen y tiempo cryosectioning.

Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Este método de ahorro de tiempo reduce la variabilidad entre rondas de procedimientos inmunohistoquímicos en estudios de neurociencia para optimizar la visualización de la anatomía y proteínas y tejidos locales. La principal ventaja de esta técnica es que reduce el tiempo que se tarda en la criocirión y montar el tejido cerebral mediante la combinación de múltiples cerebros en un solo bloque congelado. Mientras que esta técnica está optimizada para secciones coronales de cerebros de roedores, se puede adaptar a secciones sagitales o transversales o diferentes tipos de tejidos como el músculo o el hígado.Después de una perfusión transcardial exitosa, después de arreglar el cerebro de los animales en un vial de 25 mililitros de 4%paraformaldehído en PBS durante 24 horas. Después de esto, usa fórceps con puntas contundentes para eliminar los cerebros del paraformaldehído. Transfiera el cerebro a un vial con aproximadamente 20 mililitros de solución de sacarosa al 30% en TBS.Mantenga el cerebro y la solución hasta que se hundan en la parte inferior del vial. A continuación, coloque un vaso de vidrio de 500 mililitros sobre una cama de hielo seco en un cubo de hielo. A continuación, vierta de 300 a 400 mililitros de isopentano en el vaso de precipitados.Mantenga el isopentano entre 45 negativos y 50 grados centígrados negativos. En la parte superior del banco, llene un molde de incrustación desechable aproximadamente a mitad de camino completo con la temperatura de corte óptima o el compuesto OCT. Utilice una aguja para eliminar cualquier burbuja de aire del molde.Utilice los fórceps con puntas contundentes para eliminar el primer cerebro de la solución de sacarosa. A continuación, utilice una nueva cuchilla de afeitar para eliminar el cerebelo y las bombillas olfativas antes de separar los hemisferios. A continuación, dé a los cerebros un sistema de nomenclatura numérico.Usa fórceps contundentes, recoge el cerebro que se colocará en la posición dos y orientalo con el lado que se corta primero mirando hacia arriba. Baje el cerebro en el OCT y utilice las pinzas para ajustar su posición hasta que se posicione de forma independiente. Una modificación clave de esta técnica es el espacio en blanco en la posición uno.Este espacio está designado para permitir una fácil identificación de la orientación del megacebro y por lo tanto identificar el animal asociado con cada cerebro. Después de que todos los cerebros se han colocado en el molde, añadir suficiente OCT para cubrir la parte superior del cerebro, a continuación, utilizar una aguja para eliminar cualquier burbuja de aire. Sostenga la esquina del molde con fórceps asegurando que los fórceps no se sumerjan parcialmente en el PTU.A continuación, baje el molde en el isopentano para que el tercio inferior del molde se sumerja. Después de 30 segundos, baje todo el molde en el isopentano y suéltelo de los fórceps. Después de tres minutos, utilice los fórceps para quitar el molde del isopentano.Envuelva inmediatamente el molde y su contenido en papel de aluminio y etiquételo adecuadamente. Transfiera el megacebro a un congelador negativo de 20 grados Celsius durante un mínimo de 24 horas. En primer lugar, ajuste la temperatura del gabinete de criostatos a 19 grados Celsius negativos.Retire el megacerebro del congelador y colóquelo en el criostato. A continuación, coloque un mandril y dos pinceles finos con puntas en el criostato. Después de esto, etiquete las diapositivas con el número de identificación de megabrano y el número de diapositiva y colocar las diapositivas en el calentador de diapositivas.A continuación, desenvuelva el megacerebro y use una cuchilla de afeitar para cortar las esquinas del molde. Dispensar una fina capa de OCT en el mandril. A continuación, coloque rápidamente el megacerebro en el mandril.Después de que el OCT esté completamente congelado, aplique una capa de dos milímetros de OCT alrededor de los lados del megacerebro y permita que corra por los lados sobre el mandril. Utilice una cuchilla de afeitar para eliminar cualquier exceso de OCT de los lados y la parte inferior del mandril. En primer lugar, coloque el mandril montado con el megacerebro en la cabeza del mandril del criostato.A continuación, ajuste el criostato al espesor deseado. Recortar el PTU y el tejido según sea necesario para llegar a la región cerebral deseada para la recolección de tejido. A continuación, baje la placa antivuelco hasta que descanse en el escenario y gire la manija del criostato para tomar una sola sección.Levante lentamente la placa antivuelco, teniendo cuidado de que la sección del tejido no se toque. Usa suavemente los pinceles para desenrollar la sección del tejido hasta que esté acostada. Si es necesario, sostenga el OCT plano usando los pinceles para evitar que se enrolle.A continuación, retire la diapositiva del calentador de diapositivas y coloque el lado de la etiqueta de la diapositiva hacia abajo sobre la sección del megabrancio y deje que se pegue a la diapositiva. Aplique rápidamente una gota de PBS en la sección del tejido. Usando un pincel con punta fina sumergido en PBS, cepilla cualquier burbuja en la sección de tejido y desdobla el tejido para que quede acostado sobre la diapositiva.Por último, coloque la diapositiva en el calentador de diapositivas para secar durante 45 minutos y guarde la diapositiva en 80 grados Celsius negativos. En este protocolo, se preparó tejido cerebral de nueve animales y se criocisó simultáneamente. Después de la criocirión, se puede realizar una tinción de H&E para evaluar la calidad de la crioprotección.Los resultados representativos de la molécula adaptadora de unión de calcio ionizado uno o la tinción Dea1 de microglia muestran una tinción constante entre cada cerebro del estudio en un solo megabrain. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear constantemente la temperatura mientras congela el megacebro para evitar agrietamiento o descongelación y luego volver a congelar el tejido que conduce a la integridad anormal del tejido. No se recomienda segregar diferentes grupos de tratamiento en megabranos separados, ya que esto puede crear varianza entre los grupos durante la tinción y reducir el sesgo y la subjetividad durante la toma de imágenes y el análisis.No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como usar PBE y trabajar en una capucha siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

FMRI simultánea y electrofisiología en el cerebro de roedores

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Investigación

Neurociencias

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

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Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic trasplante de precursores de interneurona en cerebros de ratón Postnatal temprana

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Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

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Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

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