Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

PCH uppdrag stödfonder stöds forskningen rapporterade detta manuskript. Författarna vill tacka Daniel Griffiths för att ta de bilder som används i siffrorna.

Megabrain tekniken har optimerats med hela och hemisected hjärnor från manliga vuxna C57Bl6 möss5, juvenil Sprague-Dawley-råttor och vuxna Sprague-Dawley-råttor som var transcardially perfusion med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 4% PARAFORMALDEHYD6. Liknande resultat kan uppnås i andra stammar av mus och råtta, hos båda könen och i olika åldrar. Studien att generera data för detta manuskript används juvenil Sprague-Dawley-råttor och godkändes a...

<ol>
	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

Det bör övervägas under detta förfarande att Megabrain och dess omgivningar temperatur ständigt måste övervakas för att förhindra upptining och åter frysning av vävnad. Hjärnan kan bara tas bort från-20 ° C frysen upp till 3 gånger som varje gång det är rörd och vänster i kryostaten, med varmare fluktuerande feber, vävnaden tinar och fryser, orsakar en gelé som textur och onormal vävnad integritet10. Därför är det optimalt att klippa Megabrain alla på en gång.
<p cla...

Här presenterar vi protokollet för en ny metod, som vi kallar Megabrain, framkallade till cryosection flera gnagare brains samtidigt för nedströms immunhistokemisk förfaranden. En Megabrain möjliggör produktion av enstaka bilder som innehåller vävnad från flera djur. Denna teknik har optimerats för att skära koronalt avsnitt från 9 vuxen råtta halvklot, eller 5 vuxna full hjärnor, samtidigt. Tekniken är därför mest tillämplig i stora immunhistokemiska studier eller andra analyser som gjort på bilden monterad hjärnvävnad från en stor kohort av djur.
Immunohistokemi innebär användning av specifika antikroppar riktade mot proteiner av intresse att förstå och karakterisera deras uttryck och cellförändringar i vävnad1,2,3. Användning av immunhistokemi är utbredd inom neurovetenskap, bland andra vetenskapliga discipliner, medhjälp i cellulär och molekylär förståelse av hjärnan4. Storskaliga studier med många djur och hjärnan sektioner kan vara både resurser och tid intensivt. Som sådan, det är en mångfacetterad logiken bakom utvecklingen av Megabrain: att minska tid tillbringade kryosnitt, montering och färgning vävnad, medan följaktligen använder mindre reagenser. Dessutom möjligheten att effektivisera processen och fläcken flera hjärnor i samma runda hjälper till att lindra en del av variabiliteten mellan färgning partier, en begränsning av immunhistokemi3. Dessutom snittning en Megabrain är ett tidsbesparande alternativ till snittning enskilda frusna gnagare hjärnor och möjliggör snabb jämförelse av vävnaden mellan djur eller ens behandlingsgrupperna genom mikroskopi tekniker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

Histologi och immunohistokemi är rutinmässiga analysmetoder för att visualisera mikroskopisk anatomi och lokalisera proteiner inom biologisk vävnad. I neurovetenskap, samt en uppsjö av andra vetenskapliga områden används dessa tekniker. Immunohistokemi kan göras på bilden monterad vävnad eller friflytande sektioner. Förbereda bilden monterade prover är en dags intensiv process. Följande protokoll för en teknik, som kallas Megabrain, minskas den tid som upp till 90% till cryosection och montera hjärnvävnad genom att kombinera flera hjärnor i ett enda frysta block. Denna teknik minskar dessutom variabilitet sett mellan färgning rundor, i en stor histochemical studie. Den nuvarande tekniken har optimerats för att använda gnagare hjärnvävnad i nedströms immunhistokemiska analyser; dock kan det tillämpas olika vetenskapliga fält som använder kryosnitt.

Ett positivt slutresultat för denna procedur är vävnad som ligger platt på bilden, utan bubblor eller tårar, i orientering där de frystes. Vävnadssnitt är jämnt fördelade apart och lätt identifierbara på grund av bra placering av hjärnan i ULT och bra notation vilket visas i figur 1. Förutsatt att hjärnvävnaden samlades från djur i samma ålder, och som vävnaden var korrekt justerad i ULT, ska sektioner samlas in på en bild representera ett...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Här presenterar vi ett protokoll för att frysa och avsnitt hjärnvävnad från flera djur som en tidsbesparande alternativ till bearbetning enda hjärnor. Detta minskar färgning variabilitet under immunohistokemi och minskar tid kryosnitt och imaging.

Samtidiga kryosnitt av flera gnagare hjärnor

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Denna tidsbesparande metod minskar variabiliteten mellan omgångar av immunohistokemiska ingrepp i neurovetenskapliga studier för att optimera visualiseringen av anatomi och lokala proteiner och vävnad. Den största fördelen med denna teknik är att det minskar den tid det tar att kryosektion och montera hjärnvävnad genom att kombinera flera hjärnor i en enda fryst block. Medan denna teknik är optimerad för koronal sektioner av gnagare hjärnor, det kan anpassas till sagittal eller tvärgående sektioner eller olika typer av vävnader såsom muskler eller lever.Efter framgångsrik transcardial perfusion, post-fix hjärnan från djuren i en 25 milliliter injektionsflaska med 4%paraformaldehyd i PBS i 24 timmar. Efter detta, använd trubbiga spetstycks för att ta bort hjärnorna från paraformaldehyd. Överför hjärnorna till en injektionsflaska med cirka 20 milliliter av 30%sackaroslösning i TBS.Håll hjärnan och lösningen tills de sjunker till botten av injektionsflaskan. Därefter placerar du en 500 milliliter glasbägare på en bädd av torris i en ishink. Häll sedan 300 till 400 milliliter isopentane i bägaren.Underhåll isopentan mellan negativ 45 och negativa 50 grader Celsius. På bänkskivan fyller du en engångsinbäddningsform ungefär halvvägs full med Optimal Skärtemperatur eller OCT-förening. Använd en nål för att ta bort eventuella luftbubblor från formen.Använd den trubbiga tippade ttyckning för att ta bort den första hjärnan från sackaroslösningen. Använd sedan ett nytt rakblad för att ta bort lillhjärnan och luktlökar innan separera halvkloten. Därefter ger hjärnorna ett numeriskt namngivningssystem.Använd trubbiga tåtaningar, plocka upp hjärnan som ska placeras i position två, och orientera den med den sida som ska skäras först uppåt. Sänk ner hjärnan i OKT och använd pincetten för att justera sin position tills den står oberoende av varandra. En nyckel modifiering av denna teknik är det tomma utrymmet i position ett.Detta utrymme är utsett för att möjliggöra enkel identifiering av megabrain orientering och därför identifiera djuret i samband med varje hjärna. Efter alla hjärnor har placerats i formen, lägga till tillräcklig OCT för att täcka toppen av hjärnan, sedan använda en nål för att ta bort eventuella luftbubblor. Håll hörnet av formen med tänjaser se tänja inte blir delvis nedsänkt i OKT.Sänk sedan ner formen i isopentan så att den nedre tredjedelen av formen är nedsänkt. Efter 30 sekunder, sänka hela formen i isopentan och släpp den från tänpsen. Efter tre minuter, använd tövröparna för att ta bort formen från isopentan.Omedelbart linda in formen och dess innehåll i aluminiumfolie och märka det på lämpligt sätt. Överför megahjärnan till en negativ 20 grader Celsius frys i minst 24 timmar. Ställ först in temperaturen på kryostatskåpet till negativa 19 grader Celsius.Ta bort megabrain från frysen och placera den i kryostaten. Placera sedan en chuck och två tunna tippade penslar i kryostaten. Efter detta, etikett bilderna med megabrain identifieringsnummer och bildnummer och lägga bilderna på bilden varmare.Därefter packa upp megabrain och använda ett rakblad för att skära hörnen av formen. Fördela ett tunt lager av OCT på chucken. Placera sedan snabbt megahjärnan på chucken.Efter att OCT är helt frusen, applicera ett två millimeters lager av OCT runt sidorna av megahjärnan och låt den rinna ner längs sidorna på chucken. Använd ett rakblad för att avlägsna eventuellt överflödigt OCT från sidorna och botten av chucken. Placera först chucken monterad med megabrain på kryostatens chuckhuvud.Ställ sedan in kryostaten på önskad tjocklek. Trimma OCT och vävnad som behövs för att nå önskad hjärnregion för vävnadsinsamling. Sänk sedan antirullningsplattan tills den vilar på scenen och vrid cryostat-handtaget för att ta en enda sektion.Lyft långsamt av anti-rullplattan, var försiktig så att vävnadsdelen inte vidrörs. Använd försiktigt penslarna för att rulla upp vävnadsdelen tills den ligger platt. Om det behövs, håll OCT platt med hjälp av penslar för att förhindra rullning.Ta sedan bort bilden från bildvärmaren och håll bildetiketten nedåt över megabraindelen och låt den fastna på bilden. Snabbt tillämpa en droppe PBS till vävnadssektionen. Med hjälp av en fin tippad pensel doppad i PBS, borsta ut eventuella bubblor i vävnadssektionen och veckla ut vävnaden så att den ligger platt på bilden.Slutligen, placera bilden på bilden varmare för att torka i 45 minuter och förvara bilden på negativa 80 grader Celsius. I detta protokoll, hjärnvävnad från nio djur var beredda och cryosectioned samtidigt. Efter kryosektioner kan H&E-färgning utföras för att bedöma kryoprotektionskvaliteten.Representativa resultat av joniserad kalciumbindning adapter molekyl en eller Iba1 färgning av microglia visa konsekvent färgning mellan varje studie hjärnan på en enda megabrain. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att ständigt övervaka temperaturen medan frysning megabrain för att förhindra sprickbildning eller upptining och sedan återfrysning av vävnaden som leder till onormal vävnad integritet. Det rekommenderas inte att segregera olika behandlingsgrupper i separata megabrainer eftersom detta kan skapa varians mellan grupper under färgning och minska bias och subjektivitet under bildbehandling och analys.Glöm inte att arbeta med paraformaldehyd kan vara extremt farligt och försiktighetsåtgärder som att bära PBE och arbeta i en huva bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Samtidig fMRI och elektrofysiologi hos gnagare Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Odling av Hel, Utveckla Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, realtidsmätning av laktat koncentration och optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet hos gnagare Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Samtidig elektrofysiologiska inspelning och Micro-injektioner av hämmande medel i Gnagare Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolering, kultur och långsiktigt underhåll av primär mesencefala dopaminerga neuron från embryonala Gnagare Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic Transplantation av Interneuron prekursorer i tidig Postnatal mus hjärnor

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolisk analys av Drosophila melanogaster Larval och vuxna hjärnor

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Abbiategrasso Brain Bank protokoll för att samla in, bearbetning och karaktärisera åldrande hjärnor

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Fritt flytande immunstaining av mushjärnor

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Automatiserad multimodal stimulering och samtidig neuronal inspelning från flera små organismer

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...