Name: simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

PCH misyon destek fonları bu el yazması bildirilen araştırma desteklenen. Yazarlar Daniel Griffiths rakamlar kullanılan fotoğraf çekmek teşekkür etmek istiyorum.

Megabrain tekniği bütün ve hemisected beyin erkek yetişkin C57Bl6 fareler5, juvenil Sprague-Dawley rat ve 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) takip x ile derin transcardially edildi yetişkin Sprague-Dawley rats kullanarak optimize edilmiştir % 4 paraformaldehyde6tarafından. Benzer sonuçlar diğer suşları, fare ve sıçan, her iki cinsiyette ve farklı yaş içinde gerçekleştirilebilir. Bu el yazması için verileri oluşturmak için çalışma Juvenil Spragu...

<ol>
	<li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex.">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li><li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology?.">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?.</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome,+post-traumatic+sleep,+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse.">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).</li><li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats.">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues.">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+principles+of+cryopreservation.">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li></ol>

Megabrain ve çevresi sıcaklığı sürekli çözdürme ve doku yeniden donma önlemek için takip gerekir Bu yordam sırasında düşünülmelidir. Beyin sadece-20 ° C dondurucudan için 3 kez olarak bu değindi 's ve daha sıcak bir dalgalanan sıcaklık, doku cryostat sol Tammy'nin ve refreezes, bir jöle gibi doku ve anormal doku bütünlüğü10neden her zaman kaldırılabilir. Bu nedenle, Megabrain tek seferde kesmek için en iyi yöntemdir.
Doku fiksasyon ve cr...

Burada, iletişim kuralı için birden çok kemirgen aynı anda aşağı akım immunohistokimyasal yordamlar için beyin cryosection için geliştirilen Megabrain dediğimiz bir roman yöntemi mevcut. Tek slaytları içeren birden fazla hayvan dokudan üretimi için bir Megabrain sağlar. Bu teknik, aynı anda 9 yetişkin fare hemisferlerin veya 5 Yetişkin tam beyin, koronal bölümleri kesmek için en iyi duruma getirilmiş. Bu nedenle, en büyük immunohistokimyasal çalışmalar veya slayt monte beyin dokusu üzerinde hayvan büyük bir kohort yapılan diğer analizler uygulanabilir bir tekniktir.
İmmünhistokimya belirli antikor protein anlamak ve kendi ifade ve hücresel değişiklikler belirli doku1,2,3' te karakterize ilgi karşı kullanımını gerektirir. İmmünhistokimya kullanımı nörolojik araştırma, beyin4hücresel ve moleküler anlamada yardım diğer bilimsel disiplinler arasında yaygındır. Büyük ölçekli çalışmalar birçok hayvan ve beyin bölümleri içeren kaynak ve zaman yoğun olabilir. Bu nedenle, Megabrain gelişimi çok yönlü bir mantığı var: süresini azaltmak için montaj ve sonuç olarak daha az reaktifler kullanırken doku, boyama cryosectioning geçirdim. Ayrıca, yeteneği süreci hızlandırmaya ve aynı birden çok beyin leke yuvarlak bazı parçalar, bir sınırlama immünhistokimya3boyama arasında değişkenlik hafifletmeye yardımcı olur. Buna ek olarak, bir Megabrain kesit bireysel donmuş kemirgen beyin kesit için alternatif bir zaman tasarrufu ve doku hayvanlar veya bile tedavi grupları arasında hızlı karşılaştırma mikroskobu teknikleri tarafından sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, poly bottle 2.5 kg</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2-212</td>
			<td>Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Tall-Form Beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50&#176; to +50&#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Scoopula Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STANLEY Razor Blade</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>4A807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edge-Rite Microtome blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-070-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (1&#34; frost) - white</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-013-032</td>
			<td>Dilute to 1X&#160; before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 piece fine paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B079J12ZRV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>EMS065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous cryosectioning of multiple rodent brains

Histoloji ve immünhistokimya mikroskopik anatomi görselleştirmek ve proteinlerin biyolojik doku içinde yerelleştirmek için analiz rutin yöntemleri vardır. Neuroscience, yanı sıra diğer bilimsel alanları bir bolluk, bu teknikleri kullanılır. İmmünhistokimya slayt monte doku veya serbest yüzer bölümleri üzerinde yapılabilir. Slayt monte numune hazırlama bir zaman yoğun bir süreçtir. Aşağıdaki protokol için Megabrain adında bir teknik cryosection ve mount beyin dokusu tek bir donmuş blok birden çok beyin birleştirerek 90 %'e kadar geçen süre azalır. Ayrıca, bu teknik turda büyük bir histochemical çalışma boyama arasında görülen değişkenliği azaltmak. Geçerli teknik kemirgen beyin dokusu içinde aşağı akım immunohistokimyasal analizleri kullanarak için optimize edilmiş; Ancak, cryosectioning kullanan farklı bilimsel alanlar için uygulanabilir.

Bu yordam için olumlu bir sonuç hiçbir kabarcıklar veya gözyaşları içinde donmuş yönde düz slaytta yatıyor dokudur. Doku bölümler nedeniyle beyin OCT'de ve iyi gösterim olarak Şekil 1' deki gösterdiği iyi yerleşimini ayrı ve kolayca tanımlanabilir eşit aralıklandırılmış. Beyin dokusuna benzer yaş hayvanlardan toplanan ve doku düzgün Ekim uyumlu varsayılarak, bir slayt üzerinde toplanan bölümleri beyin bölgeleri hayvanlar ara...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains at JoVE.com

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.

Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Bu zaman kazandıran yöntem, anatomi ve yerel protein ve dokunun görselleştirilmesini optimize etmek için nörolojik çalışmalarda immünohistokimyasal prosedürlerin turları arasındaki değişkenliği azaltır. Bu tekniğin en büyük avantajı, birden fazla beyni tek bir donmuş blokta birleştirerek kriyoksiyon ve beyne monte etmek için geçen süreyi azaltmasidır. Bu teknik kemirgen beyinlerinin koronal bölümleri için optimize edilmiş olsa da, sagittal veya enine kesitlere veya kas veya karaciğer gibi dokuların farklı türlerine adapte edilebilir.Başarılı transkardiyal perfüzyonu takiben, PBS'de 25 mililitrelik paraformaldehit şişedeki hayvanların beyinlerini 24 saat boyunca düzeltin. Bundan sonra, paraformaldehit beyin kaldırmak için künt uçlu forseps kullanın. Beyinleri TBS'de yaklaşık 20 mililitre %30 sakaroz çözeltisi içeren bir şişeye aktarın.Onlar şişenin altına batana kadar beyin ve çözüm tutun. Sonra, bir buz kovası kuru buz bir yatak üzerine 500 mililitrelik cam kabı yerleştirin. Sonra kabın içine 300 ila 400 mililitre isopentane dökün.Negatif 45 ve negatif 50 santigrat derece arasında isopentane koruyun. Tezgahın üst kısmında, tek kullanımlık gömme kalıbını optimal kesme sıcaklığı veya OCT bileşiğiyle yaklaşık yarım tam doldurun. Kalıp herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir iğne kullanın.Sakaroz çözeltisi ilk beyin kaldırmak için künt uçlu forseps kullanın. Sonra hemisfer ayırmadan önce beyincik ve koku ampulleri kaldırmak için yeni bir jilet kullanın. Sonra, beyinsayısal bir adlandırma sistemi verin.Künt forceps kullanın, pozisyon iki yerleştirilecek beyin almak, ve yan ilk yukarı bakacak şekilde kesilecek ile yönlendirmek. OCT içine beyin indirin ve bağımsız durana kadar konumunu ayarlamak için cımbız kullanın. Bu tekniğin önemli bir değişiklik pozisyon bir boş alandır.Bu alan megabeyin yönünün kolayca tanımlanmasını sağlamak ve bu nedenle her beyinle ilişkili hayvanı tanımlamak için belirlenmiştir. Tüm beyinler kalıp konumlandırılmış sonra, beynin üstleri kapsayacak yeterli OCT eklemek, sonra herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir iğne kullanın. Perçelerin OKT'de kısmen batırılmasını sağlamasını sağlayan persepslerle kalıbın köşesini tutun.Daha sonra, kalıp içine kalıp indirin böylece kalıp alt üçte sular altında. 30 saniye sonra, isopentane içine tüm kalıp indirin ve forceps bırakın. Üç dakika sonra, isopentane kalıp kaldırmak için forceps kullanın.Hemen alüminyum folyo kalıp ve içeriğini sarın ve uygun etiket. Megabeyni en az 24 saat boyunca negatif 20 derecelik bir dondurucuya aktarın. İlk olarak, kriyostat kabinenin sıcaklığını negatif 19 dereceye ayarlayın.Dondurucudan megabeyni çıkarın ve kriyostat yerleştirin. Sonra kriyostat bir chuck ve iki ince uçlu boya fırçaları yerleştirin. Bundan sonra, slaytları megabeyin kimlik numarası ve slayt numarasıyla etiketlendirin ve slaytları kaydırak ısıtıcıya yerlebir edin.Sonra, megabeyin açın ve kalıp köşeleri kesmek için bir jilet kullanın. Chuck üzerine OCT ince bir tabaka dağıtın. Sonra hızlı bir şekilde chuck üzerinde megabrain yerleştirin.OCT tamamen donduktan sonra, megabeynin kenarlarına IKI milimetrelik bir EKIM katmanı uygulayın ve aynanın üzerine yanlardan aşağı doğru çalışmasına izin verin. Chuck'ın kenarlarından ve altından fazla OCT'yi kaldırmak için bir jilet kullanın. İlk olarak, chuck kriyostat chuck başında megabrain ile monte pozisyon.Sonra istenilen kalınlıkta kriyostat ayarlayın. Doku toplama için istenilen beyin bölgesine ulaşmak için gerekli OCT ve doku kırpın. Daha sonra sahneye dayanacak kadar anti-roll plakasını indirin ve tek bir kesit almak için kriyostat sapını çevirin.Yavaşça anti-roll plaka kaldırın, doku bölümüne dokunulmaz dikkatli olmak. Düz yatana kadar doku bölümünü çıkarmak için boya fırçalarını hafifçe kullanın. Gerekirse, yuvarlanmayı önlemek için paintbrushes kullanarak OCT düz tutun.Daha sonra slayt ıstırağını kaydırıcıdan çıkarın ve slayt etiketi tarafını megabeyin bölümünün üzerine doğru kaydırın ve slayta yapışmasını bekleyin. Hızlı bir şekilde doku bölümüne PBS bir damla uygulayın. PBS'ye batırılmış ince uçlu bir fırça kullanarak, doku bölümündeki kabarcıkları fırçalayın ve slaytta düz yatmak için dokuyu aç.Son olarak, slaytı 45 dakika kuruması için kaydırak ısıtıcısına yerleştirin ve slayı negatif 80 santigrat derecede saklayın. Bu protokolde dokuz hayvanın beyin dokusu aynı anda hazırlandı ve kriyodize edildi. Kriyoding inardından sonra, Kriyokoruma kalitesini değerlendirmek için H&E boyama yapılabilir.Mikroglianın iyonize kalsiyum bağlayıcı molekülü bir veya Iba1 boyamasının temsili sonuçları, tek bir megabeyinüzerinde her çalışma beyni arasında tutarlı bir boyama olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken, çatlak veya erime önlemek için megabeyin donma ve daha sonra anormal doku bütünlüğüne yol açan doku yeniden donma sırasında sürekli sıcaklığı izlemek için hatırlamak önemlidir. Boyama sırasında gruplar arasında farklılık yaratabileceği ve görüntüleme ve analiz sırasında önyargı ve öznelliği azaltabileceği için farklı tedavi gruplarını ayrı ayrı megabeyinlerde ayırmak tavsiye edilmez.Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve PBE giymek ve başlıkta çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Kemirgen Beyin aynı anda fMRI ve Elektrofizyoloji

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Abbiategrasso Beyin Bankası Toplama, İşleme ve Yaşlanma Beyinleri Karakterize için Protokol

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Otomatik Multimodal Stimülasyon ve Birden Çok Küçük Organizmadan Eşzamanlı Nöronal Kayıt

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...