Name: a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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这项研究得到了 bifas 生物医疗材料方案国际金融和药物治疗项目的财政支持, 并得到了荷兰经济事务部的共同资助。作者要感谢澳大利亚莫纳什大学的 graham lieschke 教授提供斑马鱼转基因线 (mpeg1: galni-uas:kaede)。

在该议定书中, 维持成年斑马鱼符合当地动物福利委员会批准的当地动物福利条例。胚胎实验是根据 201/63/欧盟指令进行的。
1. "仅细菌" 和细菌微球悬浮液的制备
请注意:采用表达mcherry荧光蛋白 (金黄色葡萄球菌-mcherry) 的金黄色葡萄球菌 rn4220 菌株。金黄色葡萄球菌rn4220 菌株在毒力调节剂基因agra (辅助基因调节剂 a)<su...

生物材料相关感染 (bai) 是一种严重的临床并发症。更好地了解 bai 在体内的发病机制, 将为改进 bai 的预防和治疗提供新的见解。然而, 目前实验的 bai 动物模型, 如小鼠模型是昂贵的, 劳动密集型的, 需要受过复杂手术技术培训的专业人员。因此, 这些模型不适合高吞吐量分析。由于对斑马鱼胚胎模型的要求不那么复杂, 一般费用低于小鼠模型, 本研究评估了斑马鱼胚胎是否可以作为一种新的脊椎动?...

各种医疗设备 (称为 "生物材料") 越来越多地用于现代医学, 以恢复或取代人体部位 1.然而, 生物材料的植入使患者容易感染, 称为生物材料相关感染 (bai), 这是手术中植入物的主要并发症。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是两个最常见的细菌物种, 负责 bai2,3,4,5,6。植入的生物材料形成了一个表面容易受到细菌生物膜形成的影响。此外, 植入的生物材料可能会使局部免疫反应出轨, 导致细菌清除效果降低。感染细菌的初始清除主要是通过浸润中性粒细胞进行的, 中性粒细胞在植入或植入的生物材料7的存在下, 这些中性粒细胞的杀菌能力大大降低。此外, 巨噬细胞在中性粒细胞最初的涌入后渗入组织, 会吞噬剩余的细菌, 但不能有效地杀死它们的内部, 由于疯狂的免疫信号, 这是一个综合存在的结果生物材料和细菌8。因此, 生物材料的存在可以促进细菌在细胞内生存 9,10,11,12,13和生物膜形成的植入物生物材料4,14。因此, bai 可能导致无法和需要更换植入的生物材料, 导致发病率和死亡率上升, 住院时间延长, 额外费用2,15.
目前正在制定越来越多的反审调处战略 2、16、17。在体内评估这些策略在相关动物模型中的有效性是必不可少的。然而, 传统的实验 bai 动物模型 (例如,小鼠模型) 通常成本高昂、耗时长, 因此不适合多种策略的高吞吐量测试18。基于生物光学的生物光学成像技术的最新发展--宿主细胞和细菌荧光标记可能使单个小动物能够持续监测 bai 进展和宿主-病原体-材料相互作用例如小鼠18、19、20、21.然而, 这种技术相对复杂, 尚处于起步阶段, 对 bai18 进行定量分析必须解决几个问题。例如, 需要高挑战剂量来显示细菌的定植。此外, 还必须解决在哺乳动物试验动物组织中的光散射和生物发光荧光信号的吸附问题.因此, 新的、经济高效的动物模型, 允许随着时间的推移进行体内可视化和定量分析, 是在体内研究 bai 的宝贵补充系统。
斑马鱼 (胚胎) 已被用作一种多功能的体内工具, 用于解剖宿主-病原体相互作用和几种细菌的感染发病机制, 如22分枝杆菌,铜绿假单胞菌23, 大肠杆菌24例,粪便肠球菌25例, 葡萄球菌26、27例。斑马鱼胚胎具有许多优点, 如光学透明度、相对较低的维护成本以及拥有与哺乳动物高度相似的免疫系统 28, 29.这使得斑马鱼胚胎成为一个高度经济、有生命的生物, 用于对感染进展和相关宿主反应进行体内可视化和分析 28,29.为了使细胞在体内的行为可视化, 转基因斑马鱼系具有不同类型的免疫细胞 (如巨噬细胞和中性粒细胞), 甚至具有荧光标记的亚细胞结构. ,29。此外, 斑马鱼的高繁殖率提供了开发高吞吐量测试系统的可能性, 该系统具有自动机器人注射、自动荧光定量和 rna 序列分析27的特点,30岁.
在本研究中, 我们的目标是开发一个斑马鱼胚胎模型的生物材料相关感染使用荧光成像技术。为此, 我们开发了一种在生物材料微球存在的情况下将细菌 (金黄色葡萄球菌) 注入斑马鱼胚胎肌肉组织的程序。我们使用金黄色葡萄球菌rn4220 表达 mcherry 荧光蛋白 (s. aureus-mcherry), 如其他地方所描述的另一种金黄色葡萄球菌菌株10,31。采用转基因斑马鱼系 (mpeg1:uas变为 kaede), 在巨噬细胞32和蓝色荧光聚苯乙烯微球中表达了 kaede 绿色荧光蛋白。在之前的一项研究中, 我们已经证明, 肌肉注射微球到斑马鱼胚胎, 以模仿生物材料植入是可行的33。为了定量分析 bai 的进展和相关细胞浸润在单个胚胎随着时间的推移, 我们使用了 "zobravies-vantest" 项目文件, 该文件在 "objectj" (imagej 的插件) 中操作, 以量化的荧光强度细菌居住和巨噬细胞浸润在微球注射部位附近 33.此外, 我们还确定了胚胎中存在和不存在微球的菌落形成单位 (cfu) 的数量, 以研究生物材料对感染的潜在影响。我们目前的研究表明, 随着这里开发的方法, 斑马鱼胚胎是一个有前途的, 新的脊椎动物模型, 用于研究体内生物技术相关感染。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic soya agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>236950</td>
			<td>Media preparation unit at AMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soya broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2259.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)</td>
			<td>Life technology/ThemoFisher</td>
			<td>F8829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller instrument</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>Flaming p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope LM 20</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG33 10450123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose MP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope LM80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG3610450126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator M3301 with M10 stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>00-42-101-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5248ZO100329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtrube 2ml pp</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.693.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia beads</td>
			<td>Bio-connect</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA lyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td>41416401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>43671</td>
			<td>Chapmon 2 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MO512-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gyrotory shaker (for bacterial growth)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Incu-line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich-Zentrifugen</td>
			<td>ROTANTA 460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Pharmacia biotech</td>
			<td>Ultrospec&#174;2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>NL-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad 7.0</td>
			<td>Prism</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection

生物材料相关感染 (bai) 是生物技术/医疗器械失效的主要原因。金黄色葡萄球菌是 bai 的主要病原菌之一。目前实验的 bai 哺乳动物动物模型, 如小鼠模型, 成本昂贵, 耗时, 因此不适合高吞吐量分析。因此, 需要新的动物模型作为体内调查 bai 的补充系统。在本研究中, 我们的目标是开发一个斑马鱼胚胎模型, 用于基于荧光显微镜的生物材料存在下细菌感染的体内可视化和体内分析。此外, 还研究了引发的巨噬细胞反应。为此, 我们使用荧光蛋白表达金黄色葡萄球菌和转基因斑马鱼胚胎, 在巨噬细胞中表达荧光蛋白, 并开发了一种单独或与微球一起向肌肉注射细菌的程序胚胎组织。为了监测细菌感染的进展, 随着时间的推移, 我们设计了一个简单而可靠的方法, 显微镜评分荧光细菌。显微镜评分结果表明, 所有具有20多个菌落形成单位 (cfu) 细菌的胚胎都能产生细菌的阳性荧光信号。为了研究生物材料对感染的潜在影响, 我们确定了具有和不具有10μm 聚苯乙烯微球 (ps10) 的金黄色葡萄球菌的 cfu 数, 作为胚胎中的生物材料模型. 此外, 我们使用在 imagej 中运行的 objectj 项目文件 "zbrafan-vapoest" 来量化随着时间的推移有和没有 ps10 的金黄色葡萄球菌感染的荧光强度。这两种方法的结果表明, 在微球感染的胚胎中, 金黄色葡萄球菌的数量高于在没有微球的胚胎中, 这表明在生物材料存在的情况下, 感染易感性增加。因此, 本研究表明斑马鱼胚胎模型在研究 bai 方面具有应用本文所开发的方法的潜力。

本研究评估了斑马鱼胚胎作为一种新的脊椎动物动物模型在研究生物材料相关感染方面的适用性。微注射技术常用于向斑马鱼胚胎中注入不同的细菌种类, 从而引起 22、26、27、30、36种感染。利用图 1所示的步骤,将金黄色葡萄...

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A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

一种用于生物技术相关金黄色葡萄球菌感染活体可视化和内膜分析的斑马鱼胚胎模型

本研究描述了一种斑马鱼胚胎模型, 用于基于荧光显微镜的生物物质相关感染的体内可视化和体内分析。该模型是一个很有前途的系统, 补充哺乳动物动物模型, 如研究体内生物材料相关感染的小鼠模型。

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

这种方法可以帮助回答以下关键问题：生物材料如何影响感染的易感性，它们如何影响这种感染的进展，以及它们如何影响体内此类生物材料周围的免疫细胞行为。该技术的主要优点是，它提供了一种新的动物模型，允许体内可视化和生物材料相关感染的活体内分析。这种方法的视觉演示至关重要，因为生物材料微球的注入是一个非常微妙的过程。为了产生仅细菌的悬浮液，首先将荧光葡萄球菌菌株的四到五个菌落转移开，在试菌大豆农业板上培养，每毫升氯霉素补充10微克，制成10毫升的尝试性大豆汤，辅以氯霉素，在37摄氏度的中对数生长阶段生长，并摇动。当培养达到 620 纳米 0.4 至 0.8 的光学密度测量时，通过离心收集细菌，每次洗涤用一毫升无菌 PBS 洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将颗粒重新悬浮在1.1毫升PVP中，并在再次测量光学密度之前，对细菌悬浮液进行涡流。然后根据实验要求用PVP调整细菌悬浮液的浓度，产生细菌性悬浮液。为了产生细菌微球悬浮液，将商业聚苯乙烯微球PS-10离心机，并在仅细菌悬浮液中重新悬浮微球颗粒。使用 1/2 体积的 PVP 稀释细菌微球悬浮液，以达到悬浮液中细菌的适当浓度，约为仅细菌悬浮液的 2/3。通过涡流混合悬浮液。要检查细菌和细菌微球悬浮液的浓度，在96孔板的单个孔中加入100微升每个悬浮液。在随后的孔中，在 90 微升无菌 PBS 中连续稀释悬浮液的 10 微升等等，每个稀释步骤都采用新提示。将未稀释和稀释的细菌悬浮液的重复 10 微升等同液涂抹在加糖板上，并在 37 摄氏度下孵育板过夜。第二天早上，数一数菌落，计算准备好的细菌仅和细菌微球悬浮液中的细菌数量。收集斑马鱼胚胎后，丢弃任何不透明的不可行的胚胎，并在28摄氏度的新鲜E3培养基下孵育约60个每100毫升培养皿。麻醉后，将GP阳性胚胎封存，进行荧光显微镜检查。将它们转移到一个100毫升的E3培养皿。要创建注塑模具，请用 1 至 1.5% 的液体气糖填充 100 毫升 Petri 盘。使用塑料模具模板在红糖中创建凹槽。当加糖凝固时，去除模具，用E3介质覆盖加糖，并辅以0.02%三分素。受精后的第三天，用钳子打破拉玻璃微胶囊针的尖端，在光学显微镜下用大约20微米的外径实现尖端，在眼部有刻度杆。针尖开口的调整对于微球的注入是实用的。开口的直径需要为不同大小的微球进行调整。然后使用微加载器移液器尖端将针头装载约 20 微升的细菌微球或仅细菌悬浮液，然后将针头安装到连接到微注射器的微操纵器上。现在将选定的胚胎转移到凹槽的红糖板中。等待五分钟后，胚胎被麻醉，将胚胎在凹槽内以单一方向对齐，进行注射。将显微注射器设置为适当的注射设置，并在立体显微镜下以 45 至 60 度角将针头插入第一个胚胎的肌肉组织。根据需要轻轻来回移动针头，以调整组织内的位置，并使用微注射器脚踏板注入加载的悬架。当将细菌微球悬浮液注射到斑马鱼胚胎的组织时，应用稳定的手轻轻插入针头。成功插入后，应在喷射前为材料创建空间。当所有胚胎都注射后，在立体荧光显微镜下对胚胎进行评分，以成功注射，并在48孔板的单个孔中保持胚胎在E3介质中，且具有每日介质变化。为了通过菌落形成单位定量监测感染进展，在注射后不久将5至6个存活的受感染胚胎随机移植到单个两毫升微管中，然后用无菌PBS轻轻清洗胚胎。丢弃洗涤液后，在每个管中加入100微升无菌PBS，然后加入2至3个直径两毫米的无菌氧化珠。然后以3，500转/小时将胚胎粉碎在均质器中，持续30秒，并培养均质，如所证明的。将含有E3介质的100毫米培养皿放在立体荧光显微镜舞台上，在培养皿中加入500微升2%甲基纤维素。要通过荧光显微镜监测感染进展，请配备适当的亮场和荧光过滤器，将麻醉受感染的胚胎水平对齐到培养皿中的甲基纤维素点。使用亮场过滤器，以 160 倍的放大倍率将受损的注射组织对焦。将 Z 堆栈深度设置为 10 微米，将步长设置为 5 微米，以便连续录制三张图像。然后在相同的优化设置下以 160 倍的放大倍率成像单个胚胎。使用 ImageJ 中的 ObjectJ 插件分析图像。金黄色葡萄球菌的肌肉注射在胚胎中引发剂量依赖性感染，在胚胎中观察到可行的感染进展，在注射后的第一天和第二天施以高挑战剂量。如所证明，在微球存在或不存在的情况下，可以注射类似数量的细菌。通常，所有具有20多个金黄色葡萄球菌成分之一的胚胎在显微评分下对荧光呈阳性，尽管微球的存在似乎没有显著影响低剂量受挑战胚胎的感染进展。在高量接受的受挑战胚胎中，显微评分并不显示有或没有微球的受感染胚胎频率有任何差异，但定量培养表明，与注射后两天从金黄色葡萄球菌群胚胎中检索到的胚胎相比，从胚胎中检索到的菌落形成单位数较高。生物材料的存在影响免疫细胞反应和感染的初始易感性。例如，在注射后五小时，对金黄色葡萄球菌注射反应的巨噬细胞的渗透明显高于对金黄色葡萄球菌加微球注射的反应，而在注射后一天，具有微球的胚胎比没有微球的金黄色葡萄球的胚胎明显高于金黄色葡萄球菌感染水平。重要的是要记住，始终调整针尖的开口到生物材料的大小，并调整细菌浓度的比例在细菌只悬浮和细菌微球悬浮。这种斑马鱼胚胎模型允许体内可视化和体内对感染进展和在生物材料存在和不存在的情况下被刺激的免疫细胞反应进行体内分析。该技术为抗菌生物材料的发展和安全医疗器械的治疗策略提供了一种新的全动物模型。

Research

JoVE Journal

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