Name: a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

Cette étude a été financièrement soutenue par le projet d’IBIZA du programme matériel biomédical (BMM) et cofinancée par le ministère néerlandais des affaires économiques. Les auteurs souhaite remercier Prof. Dr. Graham Lieschke de l’Université Monash en Australie pour fournir la lignée transgénique de poisson-zèbre (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Dans ce protocole, maintenance de poissons zèbres adultes est conforme au règlement de bien-être animal local tel qu’approuvé par le comité local de bien-être animal. Expériences avec des embryons ont été effectuées conformément à la Directive 2010/63/UE.
1. préparation des « Bactéries seulement » et des Suspensions de bactéries-microsphères
Remarque : La souche de S. aureus RN4220 exprimant la protéine fluorescente mC...

Infection associée aux biomatériaux (BAI) est une complication grave de clinique. Une meilleure compréhension de la pathogenèse de BAI in vivo pourrait apporter un nouvel éclairage pour améliorer la prévention et le traitement de BAI. Cependant, actuel BAI des modèles animaux expérimentaux tels que les modèles murins sont coûteuses et fastidieuses et nécessitent un personnel spécialisé formés aux techniques chirurgicales complexes. Par conséquent, ces modèles ne conviennent pas pour analyse à haut débi...

Une variété de dispositifs médicaux (dénommé « biomatériaux ») sont plus utilisés dans la médecine moderne à restaurer ou remplacer des parties de corps humain1. Toutefois, l’implantation des biomatériaux prédispose un patient à l’infection, appelée une infection associée aux biomatériaux (BAI), qui est une complication majeure des implants en chirurgie. Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis sont deux espèces de bactéries plus répandus responsables de BAI2,3,4,5,6. Implanté à forme de biomatériaux une surface sensible à la formation de biofilm bactérien. En outre, réponse immunitaire locale peut être dérangée par les biomatériaux implantés, causant une efficacité réduite de clairance bactérienne. Le dégagement initial d’infectant des bactéries est effectué principalement par infiltration de neutrophiles, qui ont fortement réduit la capacité bactéricide en présence d’inséré ou un biomatériau7. En outre, macrophages s’infiltrer dans les tissus après que l’afflux initial de neutrophiles vont phagocyter les bactéries restantes, mais ne peuvent pas efficacement les tueront intracellulaire, en raison de dérangé immunitaire de signalisation qui est une conséquence de la présence combinée de le biomatériau et bactéries8. Ainsi, la présence des biomatériaux peut faciliter la survie intracellulaire des bactéries9,10,11,12,13 et biofilm formation sur l’implant biomatériaux,4,14. Par conséquent, BAI peut conduire à l’échec et nécessaire pour le remplacement des biomatériaux implantables, causant une augmentation de la morbidité et de mortalité et d’hospitalisation prolongée avec des coûts supplémentaires2,15.
Un nombre croissant de stratégies anti-BAI est actuellement développés2,16,17. Évaluation in vivo de l’efficacité de ces stratégies dans des modèles animaux pertinents est essentielle. Cependant, les traditionnels modèles animaux expérimentaux de la BAI (p. ex., les modèles de souris, ) sont généralement coûteux, chronophages et donc ne convient pas pour le haut débit test de multiples stratégies18. Développement récent des techniques d’imagerie bio-optique basé sur bioluminescent/fluorescent étiquetage des bactéries et des cellules de l’hôte peut permettre la surveillance continue des interactions de progression et hôte-pathogène-matériel/hôte BAI en simples petits animaux comme les souris18,19,20,21. Cependant, cette technique est relativement complexe et encore à ses balbutiements, et plusieurs questions doivent être traitées pour l’analyse quantitative de BAI18. Par exemple, une dose de provocation élevée est nécessaire pour visualiser la colonisation bactérienne. En outre, la lumière diffusion et adsorption des signaux de bioluminescence/fluorescence dans les tissus des essais chez les mammifères, les animaux doivent être également adressée à18,19,21. Par conséquent, des modèles animaux innovatrice et rentables permettant une visualisation intravitale et analyse quantitative au fil du temps sont des systèmes complémentaires utiles pour l’étude in vivo de BAI.
Poisson-zèbre (embryons) ont servi comme un outil polyvalent in vivo pour disséquer les interactions hôte-pathogène et la pathogenèse de l’infection de plusieurs espèces de bactéries telles que les mycobactéries22, Pseudomonas aeruginosa,23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25et staphylocoques26,27. Des embryons de poisson-zèbre présentent de nombreux avantages tels que la transparence optique, un coût d’entretien relativement faible et la possession d’un système immunitaire très semblable à celui des mammifères28,29. Cela rend les embryons de poisson-zèbre, un organisme modèle très économique, vivant pour intravitale visualisation et l’analyse de la progression de l’infection et hôtes réponses28,29. Pour permettre la visualisation du comportement de la cellule zebrafish in vivo, transgénique lignes avec différents types de cellules immunitaires (par exemple, les, macrophages et les neutrophiles) et même avec des structures subcellulaires fluorescent marqués ont été mis au point28 ,29. En outre, le taux de reproduction élevé du poisson-zèbre offre la possibilité de développer des systèmes de test haut débit avec injection robotique automatisée, quantification de fluorescence automatisé et RNA sequence analysis27, 30.
Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour infection associée aux biomatériaux à l’aide de techniques d’imagerie de fluorescence. À cette fin, nous avons développé une procédure pour injecter des bactéries (Staphylococcus aureus) en présence de microsphères de biomatériau dans le tissu musculaire des embryons de poisson-zèbre. Nous avons utilisé des S. aureus RN4220 exprimant mCherry protéine fluorescente (s. aureus- mCherry), qui a été construite comme ailleurs pour un autre S. aureus souche10,31. La ligne zebrafish transgénique (mpeg1 : SAMU/Kaede) exprimant Kaede protéine fluorescente verte dans les macrophages32 et bleu fluorescent des microsphères de polystyrène ont été utilisés. Dans une étude précédente, nous avons montré qu’une injection intramusculaire de microsphères dans des embryons de poisson-zèbre pour imiter l’implantation biomatériau est faisable33. Quantitativement, analyser la progression de BAI et l’infiltration de cellules associées chez les embryons unique au fil du temps, nous avons utilisé le fichier de projet de « Poisson-zèbre-Immunotest » qui est utilisé dans un « ObjectJ » (un plug-in pour ImageJ) pour quantifier l’intensité de la fluorescence de les bactéries résidant et macrophages infiltrant à proximité du site d’injection de microsphères33. En outre, nous avons déterminé les numéros formant des colonies (UFC) d’unités de bactéries en présence et en absence des microsphères dans les embryons d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur l’infection. Notre étude montre qu’avec les méthodes développées ici, l’embryon de poisson zèbre est un modèle animal vertébré prometteur, roman pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic soya agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>236950</td>
			<td>Media preparation unit at AMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soya broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2259.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)</td>
			<td>Life technology/ThemoFisher</td>
			<td>F8829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller instrument</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>Flaming p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope LM 20</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG33 10450123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose MP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope LM80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG3610450126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator M3301 with M10 stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>00-42-101-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5248ZO100329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtrube 2ml pp</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.693.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia beads</td>
			<td>Bio-connect</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA lyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td>41416401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>43671</td>
			<td>Chapmon 2 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MO512-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gyrotory shaker (for bacterial growth)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Incu-line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich-Zentrifugen</td>
			<td>ROTANTA 460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Pharmacia biotech</td>
			<td>Ultrospec&#174;2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>NL-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad 7.0</td>
			<td>Prism</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection

Infection associée aux biomatériaux (BAI) est des principales causes de l’échec de biomatériaux/appareils médicaux. Staphylococcus aureus est l’un des principaux pathogènes en BAI. Cours expérimentales animales mammifères de BAI modèles tels que les modèles murins sont coûteuses et chronophages et donc pas adapté à l’analyse à haut débit. Ainsi, les nouveaux modèles animaux comme des systèmes complémentaires pour enquêter sur les BAI in vivo sont souhaitées. Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection bactérienne en présence de biomatériaux basés sur la microscopie de fluorescence. En outre, la réponse provoquée macrophage a été étudiée. À cette fin, nous avons utilisé fluorescent protéine exprimant S. aureus et embryons de poisson-zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les macrophages et mis au point une procédure pour injecter des bactéries, seuls ou avec des microsphères dans le muscle tissus d’embryons. Pour suivre l’évolution de l’infection bactérienne chez les embryons vivants au fil du temps, nous avons conçu une méthode simple mais fiable de la notation microscopique de bactéries fluorescentes. Les résultats de marquer microscopiques ont montré que tous les embryons avec plus de 20 unités formant colonie (UFC) de bactéries a donné un signal positif fluorescent de bactéries. Afin d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur infection, nous avons déterminé le nombre d’UFC de S. aureus avec et sans des microsphères de polystyrène 10 µm (PS10) comme les biomatériaux de modèle chez les embryons. En outre, nous avons utilisé le fichier de projet ObjectJ « Poisson-zèbre-Immunotest » opérant dans ImageJ pour quantifier l’intensité de la fluorescence de l’infection à Staphylococcus aureus avec et sans PS10 au fil du temps. Les résultats de ces deux méthodes ont montré un nombre plus élevé de S. aureus dans des embryons infectés avec microsphères que chez les embryons sans microsphères, indiquant une susceptibilité accrue d’infection en présence de ce biomatériau. Ainsi, cette étude montre le potentiel du modèle embryon de poisson zèbre pour étudier BAI avec les méthodes développées ici.

La présente étude a évalué l’applicabilité des embryons de poisson-zèbre comme un nouveau modèle animal vertébré pour enquêter sur les infections associées aux biomatériaux. Technique de microinjection a été couramment utilisé pour injecter différentes espèces bactériennes dans des embryons de poisson-zèbre pour causer une infection22,26,27,30</su...

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A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Un modèle d’embryon de poisson zèbre pour In Vivo visualisation et analyse Intravitale du biomatériau associée à Staphylococcus aureus Infection

La présente étude décrit un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection associée aux biomatériaux au fil du temps basée sur la microscopie de fluorescence. Ce modèle est un système prometteur en complément des modèles animaux mammifères tels que les modèles de souris pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les biomatériaux influencent la susceptibilité à l’infection, comment ils influencent la progression de ces infections, et comment ils affectent le comportement des cellules immunitaires autour de ces biomatériaux in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un nouveau modèle animal qui permet la visualisation in vivo et l’analyse intravitale des infections associées aux biomatériaux. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car l’injection de microsphériques biomatériaux est une procédure très délicate.Pour générer une suspension à bactéries seulement, transférez d’abord quatre à cinq colonies de la souche fluorescente Staph aureus mCherry, cultivés sur des plaques tryptiques d’agriculture de système complétées par 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol en 10 millilitres de bouillon de systeptique complétés par du chloramphéniophol, pour une croissance dans la phase de croissance mi-logarithmique à 37 degrés Celsius avec secousses. Lorsque la culture atteint une mesure de densité optique à 620 nanomètres de 0,4 à 0,8, recueillir les bactéries par centrifugation, et laver les cellules deux fois avec un millilitre de PBS stérile par lavage. Après le deuxième lavage, resuspendre la pastille en 1,1 millilitres de PVP, et vortex la suspension bactérienne avant de mesurer la densité optique à nouveau.Ajustez ensuite la concentration de la suspension bactérienne avec pvp selon les exigences expérimentales pour générer la suspension bactéries seulement. Pour générer une suspension de microsphère bactérienne, centrifugeuse microsphériques de polystyrène commercial, PS-10, et de résuspendre la pastille de microsphère dans la suspension bactéries seulement. Diluer la suspension de la microsphère bactérienne avec un volume de 1/2 de PVP pour atteindre une concentration appropriée de bactéries dans la suspension qui est d’environ 2/3 de celle de la suspension bactéries seulement.Mélanger la suspension par vortex. Pour vérifier la concentration de la suspension de microsphère bactéries seulement et bactéries, ajouter 100 microlitres de chaque suspension aux puits individuels d’une plaque de 96 puits. Diluer en série 10 aliquots microlitres des suspensions dans 90 microlitres de PBS stériles dans les puits suivants, en utilisant des conseils frais pour chaque étape de dilution.Appliquez des aliquots de 10 microlitres en double des suspensions bactériennes non diluées et diluées sur les plaques d’agar, et incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, comptez les colonies pour calculer le nombre de bactéries dans les suspensions de microsphère préparées uniquement par les bactéries et les bactéries. Après avoir recueilli les embryons de poisson zèbre, jetez les embryons non transparents non viables et incubez environ 60 embryons par boîte de Pétri de 100 millilitres à 28 degrés Celsius dans un milieu E3 frais.Après anesthésie, séquestrer les embryons gfp-positifs pour la microscopie de fluorescence. Transférez-les dans une boîte petri de 100 millilitres de milieu E3. Pour créer un moule d’injection, remplissez une boîte de Pétri de 100 millilitres d’un à 1,5 % d’agarose liquide.Utilisez un modèle de moule en plastique pour créer des rainures dans l’agarose. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, enlever le moule, et couvrir l’agar avec e3 moyen complété avec 0,02%tricaine. Un jour trois post-fertilisation, utiliser des forceps pour briser la pointe d’une aiguille microcapillllaire en verre tiré pour obtenir des pointes avec un diamètre externe d’environ 20 micromètres sous un microscope léger avec une barre d’échelle dans l’oculaire.L’ajustement de l’ouverture de la pointe de l’aiguille est pratique pour l’injection de microsphère. Le diamètre de l’ouverture doit être ajusté pour les microsphériques de différentes tailles. Ensuite, utilisez une pointe de pipette Microloader pour charger l’aiguille avec environ 20 microlitres de la microsphère bactérienne ou de la suspension bactérienne seulement, et monter l’aiguille sur un micromanipulateur relié à un microinjecteur.Maintenant, transférez les embryons sélectionnés à la plaque d’agarose rainurée. Après avoir attendu cinq minutes pour que les embryons soient anesthésiés, aligner les embryons dans les rainures en une seule orientation pour leur injection. Réglez le microinjecteur dans les paramètres d’injection appropriés et insérez l’aiguille dans le tissu musculaire du premier embryon à un angle de 45 à 60 degrés au microscope stéréo.Déplacez doucement l’aiguille d’avant en arrière pour ajuster la position dans le tissu au besoin, et utilisez la pédale de pied de microinjecteur pour injecter la suspension chargée. Lors de l’injection d’une suspension de microsphère bactérienne dans le tissu des embryons de poisson zèbre, l’aiguille doit être insérée doucement, mais avec une main ferme. Après une insertion réussie, un espace doit être créé pour les matériaux avant l’injection.Lorsque tous les embryons ont été injectés, marquer les embryons pour une injection réussie au microscope à fluorescence stéréo, et maintenir les embryons dans e3 milieu sans tricaine dans les puits individuels de plaques de 48 puits avec des changements moyens quotidiens. Pour surveiller la progression de l’infection par quantification des unités formant des colonies, transférez au hasard cinq à six embryons infectés viables dans des microtubes individuels de deux millilitres peu de temps après l’injection, et lavez doucement les embryons avec du PBS stérile. Après avoir jeté les lavages, ajouter 100 microlitres de PBS stérile à chaque tube, suivi de deux à trois perles stériles de zirconia de deux millimètres de diamètre.Ensuite, écraser les embryons dans un homogénéisateur à 3500 rpm pendant 30 secondes, et la culture de l’homogénéité comme démontré. Placez une boîte petri de 100 millimètres contenant e3 moyen complété avec 0,02% tricaine sur un stade de microscope à fluorescence stéréo, et ajouter 500 microlitres de 2% méthylcellulose dans la boîte de Petri. Pour surveiller l’évolution de l’infection par microscopie par fluorescence, équipez les filtres fluorescents et à champ lumineux appropriés, alignez horizontalement les embryons infectés anesthésiés dans une tache de méthylcellulose dans une boîte de Pétri.Utilisez le filtre à champ lumineux pour mettre en lumière le tissu injecté endommagé lors d’un grossissement de 160 x. Réglez la profondeur de la pile Z à 10 micromètres et la taille de l’étape à cinq micromètres pour permettre l’enregistrement de trois images consécutives. Puis imagez les embryons individuels dans des réglages optimisés identiques à un grossissement 160x.Utilisez le plugin ObjectJ dans ImageJ pour analyser les images. L’injection intramusculaire de Staph aureus déclenche une infection dépendante de la dose chez les embryons, avec une progression viable de l’infection observée chez les embryons administrés à des doses à haut défi aux jours un et deux après l’injection. Comme démontré, il est possible d’injecter un nombre similaire de bactéries en présence ou en l’absence de microsphériques.Typiquement, tous les embryons avec plus de 20 unités colonie-formation de Staph aureus mCherry sont positifs pour la fluorescence sous la notation microscopique, bien que la présence des microsphériques semble ne pas influencer de manière significative la progression d’infection dans les embryons contestés à faible dose. Chez les embryons à dos élevé, la notation microscopique ne démontre aucune différence dans la fréquence des embryons infectés avec ou sans microsphériques, mais la culture quantitative révèle des nombres d’unités de formation de colonies plus élevés prélevés sur des embryons dans le groupe staph aureus plus microsphère par rapport à ceux récoltés dans le groupe Staph aureus seulement à deux jours après l’injection. La présence d’un biomatériau influence à la fois la réponse des cellules immunitaires et la susceptibilité initiale à l’infection.Par exemple, à cinq heures après l’injection, l’infiltration de macrophages en réponse à une injection staph aureus seulement est significativement plus élevée qu’en réponse à un aureus staphylocoque plus l’injection de microsphériques, tandis qu’à un jour après l’injection, les embryons avec des microsphériques présentent des niveaux significativement plus élevés d’infection à Staph aureus que les embryons sans microsphère. Il est important de se rappeler d’ajuster toujours l’ouverture de la pointe de l’aiguille à la taille des biomatériaux et d’ajuster le rapport de la concentration de bactéries dans la suspension bactéries seulement et la suspension de la microsphère bactérienne. Ce modèle embryonnaire de poisson zèbre permet la visualisation in vivo et l’analyse intravitale de la progression de l’infection et des réponses des cellules immunitaires provoquées en présence et en absence de biomatériaux.Cette technique fournit un nouveau modèle animal entier pour le développement de biomatériaux antimicrobiens et de stratégies de traitement pour des dispositifs médicaux sûrs.

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