Name: a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

מבחינה כלכלית, מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט איביזה של התוכנית חומר ביו-רפואי (BMM), והיתה שותפה במימון הולנדית משרד חקירות כלכליות. המחברים רוצה להודות פרופ ' ד ר גרהם Lieschke מאוסטרליה, אוניברסיטת מונש למתן הקו דג זברה מהונדס (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

ב פרוטוקול זה, תחזוקה של דג זברה בוגרת עומדת בדרישות תקנות רווחת בעלי חיים מקומיים כפי שאושר על ידי ועדת רווחת בעלי חיים מקומיים. ניסויים עם עוברי בוצעו על פי הדירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי.
1. הכנת "חיידקים בלבד", תרחיפי החיידקים-microspheres
הערה: המתח RN4220 S...

זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא סיבוך רפואי חמור. הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של באי ויוו תספק תובנות חדשות על מנת לשפר את מניעה וטיפול של באי. עם זאת, הנוכחי ניסיוני באי מודלים בעלי חיים כגון מודלים מאתר יקר, עתירי עבודה, והן דורשות אנשי סגל מומחים ברפואת טכניקות ניתוחיות מורכבות. לכן, מודלים א...

מגוון רחב של מכשירים רפואיים (המכונה "biomaterials") משמשים יותר ויותר ברפואה המודרנית לשחזר או להחליף את גוף האדם חלקים1. עם זאת, ההשתלה של biomaterials predisposes מטופל זיהום, בשם הקשורים biomaterial זיהום (באי), אשר אחד הסיבוכים העיקריים של שתלים בניתוח. Staphylococcus aureus סטפילוקוקוס epidermidis שתי הנפוצות ביותר מיני החיידקים אחראי באי2,3,4,5,6בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מושתלים biomaterials טופס משטח ביופילמים חיידקים רגישים. יתר על כן, תגובה חיסונית מקומית עשויה להיות מופרע על ידי biomaterials מושתל, גורם היעילות מופחתת של חיסול חיידקים סיווג ראשוני של הדבקה חיידקים מתבצע בעיקר על ידי הסתננות נויטרופילים, אשר בתוקף מופחתת קיבולת אחרים בנוכחות שנוסף או מושתל biomaterial7. יתר על כן, מקרופאגים שחדר הרקמה אחרי זרם הראשונית של נויטרופילים phagocytose את החיידקים הנותרים אבל לא יעיל להרוג אותם intracellularly, עקב מטורף החיסונית איתות כי הוא תוצאה של המצאות משולב biomaterial וחיידקים8. לכן, הנוכחות של biomaterials יכול להקל על תאיים הישרדות של חיידקים9,10,11,12,13 biofilm היווצרות על מושתל 4,biomaterials14. כתוצאה מכך, באי עשוי להוביל לכשל, זקוק להחלפה של מושתל biomaterials, גורם תחלואה מוגברת ואת התמותה, אשפוז ממושך עם עלויות נוספות2,15.
מספר גדל והולך של אנטי-באי אסטרטגיות מתבצעת מפותחת2,16,17. In vivo הערכת יעילות של אסטרטגיות אלו הרלוונטיים במודלים של בעלי חיים היא חיונית. אולם, מסורתי באי בעלי חיים ניסיוניות (למשל, העכבר דגמים) הם בדרך כלל יקרים, זמן רב, ולכן לא מתאים לבדיקה תפוקה גבוהה של אסטרטגיות מרובות18. התפתחות של ביו-אופטיים טכניקות הדמיה המבוססת על זוהרים/פלורסנט תיוג של התאים המארחים וחיידקים עשוי לאפשר לניטור רציף של האינטראקציות התקדמות, המארח-פתוגן/מארח-חומר באי בודד חיות קטנות כגון עכברים18,19,20,21. עם זאת, טכניקה זו מורכבות יחסית עדיין בחיתוליו, ויש מספר בעיות שמחייבות לניתוח כמותי של באי18. למשל, מנה האתגר גבוהה נדרשת כדי להמחיש מושבת חיידקים. בנוסף, אור פיזור, ספיחה של אותות ביולומינסנציה/זריחה ברקמות של מבחן בתרבית של בעלי חיים צריך להיות גם התייחס18,19,21. לכן, חדשנית, חסכונית מודלים בעלי חיים המאפשר ויזואליזציה intravital וניתוח כמותי לאורך זמן הן מערכות משלימות יקר ללמוד באי ויוו.
דג זברה (עוברי) שימשו ככלי ויוו רב-תכליתי ניקוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, זיהום בפתוגנזה של מספר מינים חיידקי mycobacteria22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli26,24, Enterococcus faecalis25ו- staphylococci27. דג זברה עוברי יש יתרונות רבים כגון שקיפות אופטית, עלות תחזוקה נמוכה יחסית וכן אחזקת מערכת חיסונית דומה מאוד לזו יונקים28,29. זה הופך את העוברים דג זברה אורגניזם מודל כלכלי מאוד, חי ויזואליזציה intravital וניתוח של התקדמות הזיהום, המארח המשויך תגובות28,29. כדי לאפשר ויזואליזציה של התנהגות התא דג זברה ויוו, הטרנסגניים קווים עם סוגים שונים של תאים חיסוניים (למשל, מקרופאגים, נויטרופילים), אפילו עם מבנים subcellular fluorescently מתויג היה פותח28 ,29. בנוסף, שיעור גבוה רבייה של דג זברה מספק את האפשרות לפתח מערכות בחינה תפוקה גבוהה הכוללת הזרקה אוטומטית רובוטית, כימות פלורסצנטיות אוטומטיות ולאחר ניתוח רצף הרנ א27, 30.
במחקר הנוכחי, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה biomaterial-הקשורים בזיהום באמצעות טכניקות הדמיה זריחה. לשם כך, פיתחנו הליך להזריק חיידקים (S. aureus) בנוכחות biomaterial microspheres לתוך רקמות שריר של דג זברה העוברים. השתמשנו S. aureus RN4220 לביטוי mCherry חלבון פלואורסצנטי (S. aureus- mCherry), אשר נבנה כמתואר עבור S. aureus עוד זן10,31. הקו דג זברה מהונדס (mpeg1: קאךה/UAS) המבטאת קאךה חלבון פלואורסצנטי ירוק, המקרופאגים32 ו כחול ניאון פוליסטירן microspheres שימשו. במחקר הקודם, אנחנו הראו כי זריקה תוך שרירית של microspheres לתוך דג זברה עוברי לחקות biomaterial ההשתלה הוא ריאלי33. לנתח באופן כמותי את ההתקדמות של באי וחדירה תא המשויך של אחד העוברים לאורך זמן, היינו את קובץ הפרוייקט "דג זברה-Immunotest" המופעל בתוך "ObjectJ" (יישום plug-in עבור ImageJ) לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית חיידקים השוכנים ומקרופגים שחדר באזור ההזרקה של microspheres33. בנוסף, קבענו את המספרים של המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הנוכחות ואת היעדר microspheres של העוברים ללמוד ההשפעות האפשריות של biomaterials על זיהום. המחקר הנוכחי שלנו מדגים השיטות התפתחו כאן, העובר דג זברה הוא מודל בעלי חוליות מבטיח, הרומן לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic soya agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>236950</td>
			<td>Media preparation unit at AMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soya broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2259.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)</td>
			<td>Life technology/ThemoFisher</td>
			<td>F8829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller instrument</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>Flaming p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope LM 20</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG33 10450123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose MP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope LM80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG3610450126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator M3301 with M10 stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>00-42-101-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5248ZO100329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtrube 2ml pp</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.693.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia beads</td>
			<td>Bio-connect</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA lyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td>41416401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>43671</td>
			<td>Chapmon 2 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MO512-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gyrotory shaker (for bacterial growth)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Incu-line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich-Zentrifugen</td>
			<td>ROTANTA 460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Pharmacia biotech</td>
			<td>Ultrospec&#174;2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>NL-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad 7.0</td>
			<td>Prism</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection

זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא מהווה גורם מרכזי בכישלון biomaterials/רפואי התקנים. Staphylococcus aureus הוא אחד פתוגנים העיקריים בבאי. הנוכחי ניסיוני באי חיה בתרבית של מודלים כגון עכבר הדוגמניות יקר זמן רב, ולכן לא מתאים לניתוח תפוקה גבוהה. לפיכך, מודלים חדשניים כמערכות משלימים עבור חוקרים באי ויוו הם הרצויה. בהווה לומדים, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital של זיהום חיידקי בנוכחות biomaterials מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. בנוסף, התגובה מקרופאג שעורר נחקר. למטרה זו, אנו להביע חלבון פלואורסצנטי S. aureus ו דג זברה מהונדס עוברי המבטאים חלבונים פלורסנט ב מקרופאגים שלהם ופיתח הליך להחדיר חיידקים לבד או יחד עם microspheres לתוך השריר רקמות העובר. כדי לפקח על התקדמות זיהום חיידקי העוברים לחיות לאורך זמן, אנחנו המציאו שיטה פשוטה אך אמין של הניקוד מיקרוסקופיים של חיידקים פלורסנט. התוצאות ניקוד מיקרוסקופיים הראו כי כל העוברים עם יותר מ-20 המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הניב אות ניאון חיובית של חיידקים. במחקר השפעת פוטנציאל biomaterials על זיהום, קבענו המספרים CFU של S. aureus עם ובלי microspheres 10 מיקרומטר פוליסטירן (נ. ב10) בתור מודל biomaterials ב העוברים. יתר על כן, השתמשנו קובץ פרוייקט ObjectJ "דג זברה-Immunotest" הפועלים ImageJ לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית זיהום S. aureus עם ובלי PS10 לאורך זמן. תוצאות של שתי השיטות הראו מספר גבוה יותר של S. aureus עוברי נגועים עם microspheres מאשר בעוברי ללא microspheres, המציין את הרגישות של זיהום מוגבר בנוכחות biomaterial. לפיכך, המחקר הנוכחי מראה את הפוטנציאל של המודל העובר דג זברה ללמוד באי עם השיטות התפתחו כאן.

המחקר הנוכחי העריכו את הישימות של דג זברה עוברי כמודל הרומן חוליות בבעלי חיים עבור חוקרים הקשורים biomaterial זיהום. טכניקת microinjection כבר בשימוש נפוץ להחדיר מינים שונים של חיידקים לתוך דג זברה עוברי לגרום זיהום22,26,27,<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

המחקר הנוכחי מתאר מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital לזיהום הקשורים biomaterial לאורך זמן מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מודל זה היא מערכת מבטיח משלימים מודלים בעלי חיים יונקים כגון עכבר מודלים לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על איך ביו-חומרים להשפיע על רגישות לזיהום, איך הם משפיעים על ההתקדמות של זיהומים כאלה, וכיצד הם משפיעים על התנהגות תאי החיסון סביב ביו-חומרים כאלה ב vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מודל חדשני של בעלי חיים המאפשר הדמיה של vivo וניתוח תוך-ויטראלי של זיהומים הקשורים לביו-חומרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו הזרקת מיקרוספרות ביו-חומריות הוא הליך עדין מאוד.כדי ליצור השעיה לחיידקים בלבד, העברה ראשונה ארבע עד חמש מושבות של זן פלורסנט Staph aureus mCherry, מתורבת על צלחות חקלאות סויה טריפטית בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר של כלוראמפניקול לתוך 10 מיליליטר של מרק סויה טריפטי בתוספת כלוראמפניקול, לצמיחה בשלב הצמיחה אמצע לוגריתמית ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד. כאשר התרבות מגיעה למדידת צפיפות אופטית ב 620 ננומטר של 0.4 עד 0.8, לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, יש להתריע מחדש על גלולה ב-1.1 מיליליטר של PVP, ולוורטקס את ההשעיה החיידקית לפני שמודדים שוב את הצפיפות האופטית.לאחר מכן להתאים את הריכוז של ההשעיה החיידקית עם PVP על פי הדרישות הניסיוניות כדי ליצור את ההשעיה חיידקים בלבד. כדי ליצור השעיה מיקרוספרית חיידקים, מיקרוספרות פוליסטירן מסחריות צנטריפוגות, PS-10, ולתלות מחדש את גלולת המיקרוספרה בהשעיה לחיידקים בלבד. לדלל את ההשעיה מיקרוספרה חיידקים עם נפח 1/2 של PVP כדי להגיע לריכוז מתאים של חיידקים בהשעיה כי הוא כ 2/3 מזה בהשעיה חיידקים בלבד.מערבבים את ההשעיה על ידי מערבולת. כדי לבדוק את הריכוז של החיידקים בלבד ואת השעיית מיקרוספרה חיידקים, להוסיף 100 microliters של כל השעיה בארות בודדות של צלחת 96 באר. לדלל באופן סדרתי 10 aliquots microliter של המתלים ב 90 microliters של PBS סטרילי בארות הבאות, באמצעות טיפים טריים עבור כל שלב דילול.יש למרוח עליקוטים כפולים של 10 מיקרוליטר של המתלים החיידקיים הלא מדוללים והמדוללים על צלחות אגר, ולהדגיר את הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לספור את המושבות כדי לחשב את מספר החיידקים בתוך החיידקים המוכנים בלבד ומתלים מיקרוספרה חיידקים. לאחר איסוף עוברי הזברה, השליכו עוברים בלתי שקופים שאינם שקופים, והדגירה כ-60 עוברים לכל צלחת פטרי 100 מיליליטר ב-28 מעלות צלזיוס במדיום E3 טרי.לאחר ההרדמה, יש לרוות את העוברים החיוביים ל-GFP למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מעבירים אותם לצלחת פטרי 100 מיליליטר של מדיום E3. כדי ליצור תבנית הזרקה, מלאו צלחת פטרי 100 מיליליטר עם אגרוז נוזלי אחד עד 1.5%.השתמש בתבנית עובש פלסטיק כדי ליצור חריצים באגארוז. כאשר התעוררות התגבשה, להסיר את התבנית, ולכסות את אגר עם E3 בינוני בתוספת 0.02% tricaine. יום אחד שלוש לאחר ההפריה, להשתמש במקלפות כדי לשבור את קצה מחט microcapillary זכוכית משך כדי להשיג טיפים עם קוטר חיצוני כ 20 מיקרומטר תחת מיקרוסקופ אור עם סרגל קנה מידה העין.ההתאמה של פתיחת קצה המחט היא מעשית להזרקת מיקרוספרות. יש להתאים את קוטר הפתח למיקרוספרות בגדלים שונים. לאחר מכן השתמש טיפ פיפטה Microloader כדי לטעון את המחט עם כ 20 microliters של מיקרוספרה חיידקים או חיידקים בלבד השעיה, ולהרים את המחט על micromanipulator מחובר microinjector.עכשיו להעביר את העוברים שנבחרו לצלחת אגרוז מחורצת. לאחר המתנה של חמש דקות להדמה של העוברים, יש ליישר את העוברים בתוך החריצים בכיוון אחד להזרקתם. הגדר את המיקרו-מזרק להגדרות ההזרקה המתאימות, והכנס את המחט לרקמת השריר של העובר הראשון בזווית של 45 עד 60 מעלות תחת מיקרוסקופ סטריאו.בעדינות להזיז את המחט קדימה ואחורה כדי להתאים את המיקום בתוך הרקמה לפי הצורך, ולהשתמש דוושת כף הרגל microinjector להזריק את המתלה טעון. בעת הזרקת השעיה מיקרוספרה חיידקים לתוך הרקמה של עוברי זברה, המחט צריכה להיות מוכנס בעדינות אבל עם יד יציבה. לאחר הכנסה מוצלחת, יש ליצור רווח עבור החומרים לפני ההזרקה.כאשר כל העוברים הוזרקו, ציון העוברים עבור זריקה מוצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, ולשמור על העוברים במדיום E3 ללא tricaine בארות בודדות של 48 צלחות היטב עם שינויים בינוניים יומיים. כדי לפקח על התקדמות הזיהום על ידי כימות יחידה יוצרת מושבה, להעביר באופן אקראי חמישה עד שישה עוברים נגועים קיימא לתוך microtubes שני מיליליטר בודדים זמן קצר לאחר ההזרקה, בעדינות לשטוף את העוברים עם PBS סטרילי. לאחר השלכת הכביסה, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של PBS סטרילי לכל צינור, ואחריו שניים עד שלושה חמוזי זירקוניה סטריליים בקוטר שני מילימטר.ואז למחוץ את העוברים homogenizer ב 3, 500 סל"ד במשך 30 שניות, ותרבות הומוגנית כפי שהוכח. מניחים צלחת פטרי 100 מ"מ המכילה E3 בינוני בתוספת 0.02% tricaine על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, ומוסיפים 500 microliters של 2%methylcellulose לתוך צלחת פטרי. כדי לעקוב אחר התקדמות הזיהום על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי, לצייד את השדה הבהיר המתאים מסנני פלואורסצנטי, ליישר את העוברים נגועים הרדמה אופקית בנקודה של מתילקלוז בצלחת פטרי.השתמש במסנן השדה הבהיר כדי להביא את הרקמה המוזרקת הפגומה לפוקוס בהגדלה של פי 160. הגדר את עומק מחסנית Z ב- 10 מיקרומטר ואת גודל השלב בחמישה מיקרומטרים כדי לאפשר הקלטה של שלוש תמונות רצופות. לאחר מכן תדמיין את העוברים הבודדים תחת הגדרות ממוטבות זהות בהגדלה של פי 160.השתמש בתוסף ObjectJ ב- ImageJ כדי לנתח את התמונות. הזרקה תוך שרירית של Staph aureus יוזם זיהום תלוי מינון בעוברים, עם התקדמות זיהום קיימא נצפתה בעוברים מנוהל מינונים אתגר גבוה בימים אחד ושניים לאחר הזרקה. כפי שהוכח, ניתן להזריק מספר דומה של חיידקים בנוכחות או היעדר מיקרוספרות.בדרך כלל, כל העוברים עם יותר מ -20 יחידות יוצרות מושבה של Staph aureus mCherry הם חיוביים עבור פלואורסצנטיות תחת ניקוד מיקרוסקופי, אם כי נוכחות של מיקרוספרות נראה לא משפיע באופן משמעותי על התקדמות הזיהום בעוברים מאותגרים במינון נמוך. בעוברים מאותגרים בעלי מנונים גבוהים, ניקוד מיקרוסקופי אינו מדגים הבדלים בתדר העוברים הנגועים עם או בלי מיקרוספרות, אך התרבות הכמותית חושפת מספרי יחידות גבוהים יותר של יצירת מושבה שהוחזרו מעוברים ב- Staph aureus plus microsphere Group בהשוואה לאלה שנקטפו מהקבוצה של Staph aureus בלבד ביומיים שלאחר ההזרקה. נוכחות של ביו-חומר משפיעה הן על תגובת התא החיסוני והן על הרגישות הראשונית לזיהום.לדוגמה, בחמש שעות לאחר ההזרקה, חדירת המקרופאג בתגובה להזרקה של Staph aureus בלבד גבוהה משמעותית מאשר בתגובה לאאוראוס Staph בתוספת הזרקת מיקרוספרות, ואילו ביום אחד לאחר ההזרקה, העוברים עם מיקרוספרות מפגינים רמות גבוהות משמעותית של זיהום Aureus Staph מאשר העוברים ללא מיקרוספרות. חשוב לזכור תמיד להתאים את פתיחת קצה המחט לגודל הביו-חומרים ולהתאים את היחס בין ריכוז החיידקים בהשעיה לחיידקים בלבד ואת ההשעיה המיקרוספרית של החיידקים. מודל זה של עובר זברה-דג מאפשר את הדמיה של in vivo ואת הניתוח ההפוכי של התקדמות הזיהום ואת התגובות של תאי החיסון המתגרים בנוכחותם והיעדרם של ביו-חומרים.טכניקה זו מספקת מודל חדש של בעלי חיים שלמים לפיתוח ביו-חומרים מיקרוביאליים ואסטרטגיות טיפול עבור מכשירים רפואיים בטוחים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...