Name: a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

Questo studio è stato finanziariamente supportato dal progetto IBIZA del programma materiale biomedico (BMM) e co-finanziato dal Ministero olandese degli affari economici. Gli autori desidera ringraziare il Dr. Graham Lieschke da Monash University, Australia per fornire la linea transgenica di zebrafish (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

In questo protocollo, manutenzione di zebrafish adulto è nel rispetto delle normative locali benessere degli animali, come approvato dal comitato locale benessere degli animali. Esperimenti con embrioni sono stati eseguiti secondo la direttiva 2010/63/UE.
1. preparazione del "Solo batteri" e sospensioni di batteri-microsfere
Nota: Il ceppo di S. aureus RN4220 espressione della proteina fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry) è us...

Infezione di biomateriale-collegata (BAI) è una grave complicazione clinica. Una migliore comprensione della patogenesi di BAI in vivo sarebbe fornire nuove conoscenze per migliorare la prevenzione e il trattamento di BAI. Tuttavia, corrente modelli animali sperimentali BAI come modelli murini sono costosi, laborioso e richiedono personale specializzato addestrato nelle tecniche chirurgiche complesse. Di conseguenza, questi modelli non sono adatti per alta analisi di rendimento. Poiché i requisiti per i modelli di embr...

Una varietà di dispositivi medici (denominato "biomateriali") sono sempre più utilizzati nella medicina moderna per ripristinare o sostituire parti di corpo umano1. Tuttavia, l'impianto di biomateriali predispone un paziente all'infezione, chiamato un infezione biomateriale-collegata (BAI), che è una complicazione importante di impianti in chirurgia. Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sono due specie di batteri più prevalente responsabile BAI2,3,4,5,6. Impiantato forma biomateriali una superficie sensibile alla formazione di biofilm batterico. Inoltre, la risposta immunitaria locale può essere squilibrato di biomateriali impiantati, causando ridotta efficacia della clearance batterica. Il gioco iniziale di infettare i batteri viene eseguito principalmente da infiltrazione dei neutrofili, che hanno fortemente ridotto la capacità battericida in presenza di un inserito o impiantati biomateriale7. Inoltre, i macrofagi infiltranti il tessuto dopo l'iniziale afflusso dei neutrofili verrà fagocitare i batteri rimanenti ma non può efficacemente si uccidono intracellulare, dovuto immunitario squilibrato di segnalazione che è una conseguenza della presenza combinata di il biomateriale e batteri8. Così, la presenza di biomateriali può facilitare la sopravvivenza intracellulare di batteri9,10,11,12,13 e biofilm formazione sull'impiantati biomateriali4,14. Di conseguenza, BAI potrebbe portare al fallimento e bisogno per la sostituzione dei biomateriali impiantati, causando un aumento della morbilità e mortalità e l'ospedalizzazione prolungata con costi aggiuntivi2,15.
Un numero crescente di strategie anti-BAI è stati sviluppati2,16,17. Valutazione in vivo dell'efficacia di queste strategie in modelli animali pertinenti è essenziale. Tuttavia, tradizionale BAI modelli animali (es. modelli di mouse, ) sono solitamente costosi, che richiede tempo e quindi non adatti per elevato throughput test di più strategie18. Recente sviluppo di tecniche di imaging bio-ottico basato su bioluminescenti/fluorescente etichettatura di batteri e cellule dell'ospite può permettere per il monitoraggio continuo delle interazioni di progressione e materiale-ospite-agente patogeno/host BAI in singoli piccoli animali come topi18,19,20,21. Tuttavia, questa tecnica è relativamente complessa e ancora nella sua infanzia, e diversi problemi devono essere affrontati per l'analisi quantitativa di BAI18. Per esempio, per visualizzare la colonizzazione batterica è necessaria una dose alta sfida. Inoltre, light scattering e adsorbimento di bioluminescenza/fluorescenza segnali nei tessuti dei mammiferi: saggio gli animali devono anche essere affrontate18,19,21. Di conseguenza, romanzo, conveniente modelli animali, consentendo la visualizzazione videomicroscopia e analisi quantitativa nel corso del tempo sono sistemi complementari importanti per lo studio in vivo di BAI.
Zebrafish (embrioni) sono stati usati come uno strumento versatile in vivo per la dissezione interazioni ospite-patogeno e patogenesi di infezione di varie specie batteriche come micobatteri22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25e stafilococchi26,27. Embrioni di zebrafish presentano molti vantaggi quali trasparenza ottica, un relativamente basso costo di manutenzione e possesso di un sistema immunitario molto simile a quella di mammiferi28,29. Questo rende gli embrioni di zebrafish organismo modello altamente economica, living per videomicroscopia visualizzazione e l'analisi della progressione di infezione e host associato risposte28,29. Per permettere la visualizzazione del comportamento delle cellule in vivo, transgenici zebrafish linee con diversi tipi di cellule del sistema immunitario (per esempio, macrofagi e neutrofili) e anche con strutture subcellulari fluorescente contrassegnati sono stati sviluppati28 ,29. Inoltre, il tasso di riproduzione alta di zebrafish fornisce la possibilità di sviluppare sistemi di test di velocità effettiva elevata con iniezione robot automatizzati, quantificazione automatizzata di fluorescenza e RNA sequenza analisi27, 30.
Nello studio presente, abbiamo mirato a sviluppare un modello di embrione di zebrafish per infezione biomateriale-collegata usando tecniche di imaging di fluorescenza. A tal fine, abbiamo sviluppato una procedura per iniettare batteri (Staphylococcus aureus) alla presenza di microsfere di biomateriale nel tessuto muscolare di embrioni di zebrafish. Abbiamo usato lo Staphylococcus aureus RN4220 esprimenti mCherry proteina fluorescente (s. aureus- mCherry), che è stata costruita come descritto altrove per10,un altro ceppo di Staphylococcus aureus 31. La linea di zebrafish transgenici (mpeg1: UAS/Kaede) esprimendo Kaede proteina verde fluorescente in macrofagi32 e blu fluorescente microsfere in polistirolo sono stati usati. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che l'iniezione intramuscolare di microsfere negli embrioni di zebrafish per imitare l'impianto biomateriale è fattibile33. Per analizzare quantitativamente la progressione di BAI e infiltrazione delle cellule associato a singoli embrioni nel corso del tempo, abbiamo usato il file di progetto "Zebrafish-Immunotest" che è gestito all'interno di "ObjectJ" (un plug-in per ImageJ) per quantificare l'intensità di fluorescenza di batteri che risiedono e macrofagi che si infiltrano nelle vicinanze del sito di iniezione di microsfere33. Inoltre, abbiamo determinato i numeri delle formanti colonie unità (CFU) di batteri in presenza ed assenza di microsfere negli embrioni per studiare gli effetti potenziali di biomateriali sull'infezione. Il nostro studio presente dimostra che con i metodi sviluppati qui, l'embrione di zebrafish è un promettente, romanzo vertebrato modello animale per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic soya agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>236950</td>
			<td>Media preparation unit at AMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soya broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2259.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)</td>
			<td>Life technology/ThemoFisher</td>
			<td>F8829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller instrument</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>Flaming p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope LM 20</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG33 10450123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose MP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope LM80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG3610450126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator M3301 with M10 stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>00-42-101-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5248ZO100329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtrube 2ml pp</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.693.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia beads</td>
			<td>Bio-connect</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA lyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td>41416401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>43671</td>
			<td>Chapmon 2 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MO512-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gyrotory shaker (for bacterial growth)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Incu-line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich-Zentrifugen</td>
			<td>ROTANTA 460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Pharmacia biotech</td>
			<td>Ultrospec&#174;2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>NL-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad 7.0</td>
			<td>Prism</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection

Infezione di biomateriale-collegata (BAI) è delle principali cause del fallimento di biomateriali/dispositivi medici. Lo Staphylococcus aureus è uno dei principali patogeni a BAI. Corrente sperimentale animale mammifero di BAI modelli come modelli murini sono costosi e che richiede tempo e quindi non è adatto per analisi di rendimento elevato. Così, nuovi modelli animali come sistemi complementari per lo studio in vivo di BAI sono desiderati. Nel presente studio, abbiamo mirato a sviluppare un modello di embrione di zebrafish per la visualizzazione in vivo e videomicroscopia analisi dell'infezione batterica in presenza di biomateriali basati su microscopia di fluorescenza. Inoltre, è stata studiata la risposta dei macrofagi provocata. A tal fine, abbiamo usato fluorescente che esprimono proteine S. aureus e gli embrioni di zebrafish transgenici che esprimono le proteine fluorescenti in loro macrofagi e sviluppato una procedura per iniettare i batteri da soli o insieme a microsfere nel muscolo tessuto di embrioni. Per monitorare la progressione della infezione batterica negli embrioni dal vivo nel corso del tempo, abbiamo messo a punto un metodo semplice ma affidabile di scoring microscopica di batteri fluorescenti. I risultati di segnare al microscopio ha mostrato che tutti gli embrioni con più di 20 unità formanti colonie (CFU) di batteri ha prodotto un positivo segnale fluorescente di batteri. Per studiare gli effetti potenziali di biomateriali sull'infezione, abbiamo determinato i numeri CFU di S. aureus con e senza microsfere di 10 µm in polistirene (PS10) come biomateriali modello negli embrioni. Inoltre, abbiamo usato il file di progetto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" operano in ImageJ per quantificare l'intensità della fluorescenza di S. aureus infezione con e senza PS10 nel corso del tempo. Risultati da entrambi i metodi hanno mostrato un numero maggiore di S. aureus infetti embrioni con microsfere che negli embrioni senza microsfere, che indica una suscettibilità aumentato di infezione in presenza il biomateriale. Così, lo studio presente indica il potenziale del modello di embrione di zebrafish per studiare BAI con i metodi sviluppati qui.

Il presente studio ha valutato l'applicabilità degli embrioni di zebrafish come modello animale vertebrato romanzo per indagare infezione biomateriale-collegata. Tecnica di microiniezione è stato comunemente utilizzato per iniettare diverse specie batteriche negli embrioni di zebrafish di causare infezione22,26,27,30,36. Util...

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A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Un modello di embrione di Zebrafish per nel Vivo visualizzazione e analisi videomicroscopia del biomateriale-collegata dello stafilococco aureo infezione

Il presente studio descrive un modello di embrione di zebrafish per videomicroscopia analisi di biomateriale infezione nel corso del tempo basato su microscopia di fluorescenza e la visualizzazione in vivo. Questo modello è un promettente sistema integrando modelli animali mammiferi quali modelli murini per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come i biomateriali influenzano la suscettibilità alle infezioni, come influenzano la progressione di tali infezioni e come influenzano il comportamento delle cellule immunitarie intorno a tali biomateriali in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un nuovo modello animale che consente la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale delle infezioni associate ai biomateriali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'iniezione di microsfere di biomateriali è una procedura molto delicata.Per generare una sospensione solo batterica, prima trasferire da quattro a cinque colonie del ceppo fluorescente Staph aureus mCherry, coltivato su piastre agricole di soia triptica integrate con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo in 10 millilitri di brodo di soia triptico integrato con cloramfenicolo, per la crescita nella fase di crescita medio-logaritmica a 37 gradi Celsius con scuotimento. Quando la coltura raggiunge una misurazione della densità ottica a 620 nanometri da 0,4 a 0,8, raccogliere i batteri per centrifugazione e lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS sterile per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, rimescolare il pellet in 1,1 millilitri di PVP e vortice la sospensione batterica prima di misurare nuovamente la densità ottica.Quindi regolare la concentrazione della sospensione batterica con PVP in base ai requisiti sperimentali per generare la sospensione solo batterica. Per generare una sospensione della microsfera batteriche, centrifugare microsfere commerciali di polistirolo, PS-10, e rimescolare il pellet della microsfera nella sospensione solo batteri. Diluire la sospensione della microsfera batteriche con un volume di PVP 1/2 per raggiungere un'appropriata concentrazione di batteri nella sospensione che è circa 2/3 di quella nella sospensione solo batteri.Mescolare la sospensione con il vortice. Per controllare la concentrazione della sospensione della microsfera batterica e batterica, aggiungere 100 microlitri di ogni sospensione ai singoli pozzi di una piastra da 96 porri. Diluire in serie le aliquote di 10 microlitri delle sospensioni in 90 microlitri di PBS sterile nei pozzi successivi, utilizzando punte fresche per ogni fase di diluizione.Applicare aliquote duplicate da 10 microliter delle sospensioni batteriche non diluite e diluite sulle piastre di agar e incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, conta le colonie per calcolare il numero di batteri all'interno delle sospensioni della microsfera preparate solo per batteri e batteri. Dopo aver raccolto gli embrioni di zebrafish, scartare eventuali embrioni non trasparenti non trasparenti e incubare circa 60 embrioni per piastra di Petri da 100 millilitri a 28 gradi Celsius in mezzo E3 fresco.Dopo l'anestesia, sequestri gli embrioni positivi alla GFP per la microscopia a fluorescenza. Trasferirli in una piastra di Petri da 100 millilitri di mezzo E3. Per creare uno stampo a iniezione, riempire una piastra di Petri da 100 millilitri con agarosio liquido da uno all'1,5%.Utilizzare un modello di stampo in plastica per creare scanalature nell'agarosio. Quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere lo stampo e coprire l'agar con mezzo E3 integrato con 0,02%tricaina. Un giorno tre dopo la fecondazione, utilizzare le pinza per rompere la punta di un ago microcapillare di vetro tirato per ottenere punte con un diametro esterno di circa 20 micrometri sotto un microscopio leggero con una barra di scala nell'oculare.La regolazione dell'apertura della punta dell'ago è pratica per l'iniezione di microsfere. Il diametro dell'apertura deve essere regolato per microsfere di diverse dimensioni. Quindi utilizzare una punta di pipetta Microloader per caricare l'ago con circa 20 microlitri della microsfera batterica o sospensioni solo batterica e montare l'ago su un micromanipolatore collegato a un microiniettore.Ora trasferisci gli embrioni selezionati nella piastra di agarosio scanalata. Dopo aver aspettato cinque minuti che gli embrioni siano anestetizzati, allineare gli embrioni all'interno delle scanalature in un unico orientamento per la loro iniezione. Impostare il microiniettore sulle impostazioni di iniezione appropriate e inserire l'ago nel tessuto muscolare del primo embrione con un angolo da 45 a 60 gradi al microscopio stereo.Spostare delicatamente l'ago avanti e indietro per regolare la posizione all'interno del tessuto in base alle esigenze e utilizzare il pedale del piede del microiniettore per iniettare la sospensione caricata. Quando si inietta una sospensione della microsfera batterica nel tessuto degli embrioni di zebrafish, l'ago deve essere inserito delicatamente ma con una mano ferma. Dopo un inserimento riuscito, è necessario creare uno spazio per i materiali prima dell'iniezione.Quando tutti gli embrioni sono stati iniettati, segnare gli embrioni per un'iniezione riuscita al microscopio a fluorescenza stereo e mantenere gli embrioni in mezzo E3 senza tricaina in singoli pozzi di piastre a 48 pozza con variazioni medie giornaliere. Per monitorare la progressione dell'infezione mediante quantificazione dell'unità di formazione della colonia, trasferire casualmente da cinque a sei embrioni infetti vitali in singoli microtubi da due millilitri poco dopo l'iniezione e lavare delicatamente gli embrioni con PBS sterile. Dopo aver scartato i lavaggi, aggiungere 100 microlitri di PBS sterile a ciascun tubo, seguiti da due o tre perline sterili di zirconia di due millimetri di diametro.Quindi schiacciare gli embrioni in un omogeneizzatore a 3.500 giri/min per 30 secondi e colturare l'omogeneizzato come dimostrato. Posizionare una piastra di Petri di 100 millimetri contenente mezzo E3 integrato con 0,02% di tricaina su uno stadio stereo al microscopio a fluorescenza e aggiungere 500 microlitri di metilcellulosa al 2% nella piastra di Petri. Per monitorare l'avanzamento dell'infezione mediante microscopia a fluorescenza, equipaggiare i filtri fluorescenti e a campo luminoso appropriati, allineare gli embrioni infetti anestetizzati orizzontalmente in un punto di metilcellulosa in una piastra di Petri.Utilizzare il filtro a campo luminoso per mettere a fuoco il tessuto iniettato danneggiato con un ingrandimento di 160x. Impostare la profondità dello stack Z a 10 micrometri e la dimensione del passo a cinque micrometri per consentire la registrazione di tre immagini consecutive. Quindi immagini i singoli embrioni con impostazioni ottimizzate identiche con un ingrandimento di 160x.Utilizzare il plug-in ObjectJ in ImageJ per analizzare le immagini. L'iniezione intramuscolare di Staph aureus avvia un'infezione dose-dipendente negli embrioni, con una progressione dell'infezione praticabile osservata negli embrioni somministrati dosi ad alta sfida nei giorni uno e due dopo l'iniezione. Come dimostrato, è possibile iniettare un numero simile di batteri in presenza o assenza di microsfere.Tipicamente, tutti gli embrioni con più di 20 unità di formazione di colonie di Staph aureus mCherry sono positivi per la fluorescenza sotto punteggio microscopico, anche se la presenza di microsfere sembra non influenzare significativamente la progressione dell'infezione negli embrioni sfidati a bassa dose. Negli embrioni sfidati ad alte dosi, il punteggio microscopico non dimostra alcuna differenza nella frequenza degli embrioni infetti con o senza microsfere, ma la coltura quantitativa rivela un numero di unità di formazione della colonia più elevato recuperato dagli embrioni nel gruppo Staph aureus più microsfera rispetto a quelli raccolti dal gruppo solo Staph aureus a due giorni dopo l'iniezione. La presenza di un biomateriale influenza sia la risposta delle cellule immunitarie che la suscettibilità iniziale alle infezioni.Ad esempio, a cinque ore dopo l'iniezione, l'infiltrazione di macrofagi in risposta a un'iniezione solo di Staph aureus è significativamente più alta che in risposta a un'iniezione di Staph aureus più microsfere, mentre a un giorno dopo l'iniezione, gli embrioni con microsfere mostrano livelli significativamente più alti di infezione da Staph aureus rispetto agli embrioni senza microsfere. È importante ricordare di regolare sempre l'apertura della punta dell'ago alle dimensioni dei biomateriali e di regolare il rapporto tra la concentrazione di batteri nella sospensione solo batteri e la sospensione della microsfera batteriche. Questo modello di embrione zebrafish consente la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale della progressione dell'infezione e delle risposte provocate alle cellule immunitarie in presenza e assenza di biomateriali.Questa tecnica fornisce un nuovo modello interamente animale per lo sviluppo di biomateriali antimicrobici e strategie di trattamento per dispositivi medici sicuri.

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