Name: a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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本研究は財政的に生体材料 (BMM) プログラムのイビサ島プロジェクトによってサポートされ、共同オランダ経済省によって資金を供給します。著者はゼブラフィッシュの形質転換線を提供するためオーストラリア ・ モナシュ大学から教授グラハム Lieschke を感謝したい (mpeg1:Gal4/UAS:Kaede)。

このプロトコルでは大人のゼブラフィッシュのメンテナンスは、動物愛護委員会によって承認された動物愛護法令です。2010/63/EU 指令によると胚の実験を行った。
1.「細菌のみ」と細菌微粒子懸濁液の準備
注:MCherry 蛍光蛋白質 (黄色ブドウ球菌mCherry) 表現する黄色ブドウ球菌RN4220 ひずみが使用されます。黄色ブドウ球菌</em...

生体材料関連感染 (BAI) は、深刻な病態です。バイ国際体内の病態の理解は、予防と白の治療を改善するために新しい洞察力を提供します。ただし、現在白モデル実験動物マウス モデルなどはコストのかかる、労働集約的であり、複雑な手技の訓練を受けた専門スタッフが必要があります。したがって、これらのモデルは、高いスループット分析のため適していません。本研究がゼブラフィ?...

ますますにさまざまな医療機器 (「生体材料」と呼ばれる) 現代医学で復元または人体パーツ1を置換するされます。ただし、生体材料の注入は患者を手術でインプラントの主要な合併症である生体関連感染 (白) と呼ばれる感染症素因となります。黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、2 最も一般的な細菌種の白2,3,4,5,6を担当。細菌のバイオ フィルム形成に影響を受けやすい表面生体フォームを注入しました。また、細菌クリアランスの減少効果を引き起こしている注入のバイオマテリアルによる局所免疫応答を錯乱させる可能性があります。細菌に感染した初期のクリアランスは、主に強く挿入されての存在下で殺菌能力の低下や生体材料7を注入した好中球の浸潤によって実行されます。さらに、マクロファージ組織を浸潤した好中球の初期流入残りの細菌を貪食、効果的にことはできません後それらを殺す細胞内、狂った免疫シグナリングの組み合わせの存在の結果であるため生体と細菌8。したがって、生体材料の存在が細菌9,10、11,12,13およびバイオ フィルム形成の植え付けられた細胞の生存を促進します。生体4,14。その結果、白が失敗につながるし、注入材料の交換を必要と追加コスト2,15に増加罹患率と死亡率と長期入院の原因します。
アンチ白戦略数の増加は、先進2,16,17をされています。適切な動物モデルにおけるこれらの戦略の有効性の in vivo 評価は不可欠です。しかし、伝統的な白モデル実験動物 (例えば、マウス モデル) は通常高価な時間のかかる、したがって複数の戦略18の高スループットのテストには適していません。宿主細胞や細菌の発光/蛍光ラベリングに基づく光ファイバー型バイオ イメージング技術の最近の進歩、BAI の進行およびホスト病原体/ホスト材料の相互作用単一小動物での連続モニタリングできるようにします。マウス18,19,20,21などしかし、この手法は、比較的複雑で、まだ始まったばかりで、白18の定量分析のためいくつかの問題を対処しなければなりません。例えば、細菌の植民地化を視覚化する挑戦の高線量が必要です。さらに、光散乱、動物もあります哺乳類のテストの組織における発光/蛍光信号の吸着対処18,19,21。したがって、時間をかけて生体内可視化と定量的な解析を可能にする、コスト効率の高い新しい動物モデル、BAI 体内を研究するための貴重な補完的なシステムであります。
ゼブラフィッシュ (胚) は、抗酸菌22、23緑膿菌、などいくつかの菌種の宿主-病原体相互作用と感染症を解剖するため生体内での多機能なツールとして使用されています。大腸菌ブドウ球菌腸球菌フェカリス252426,27。Zebrafish の胚には、光透過性、比較的低いメンテナンス コストと高い哺乳類28,29に類似する免疫システムの所有物など多くの利点があります。これは微小循環の可視化と感染症の進行と関連付けられたホスト応答28,29の分析のための高い経済、生活モデル生物 zebrafish の胚になります。(,マクロファージや好中球など) の免疫細胞の種類と生体内で、遺伝子導入ゼブラフィッシュ線細胞挙動の可視化を許可し、蛍光タグ細胞内構造をもされている28 を開発しました。、29。さらに、ゼブラフィッシュの高い繁殖率、自動ロボット注入、自動蛍光定量、RNA シーケンス解析27,高スループット テスト システムの開発の可能性30。
本研究では蛍光イメージング技術を用いた生体関連感染のゼブラフィッシュ胚の開発を目指しました。このため、生体微粒子の存在下でゼブラフィッシュ胚の筋組織に細菌 (黄色ブドウ球菌) を注入する手順を行った。黄色ブドウ球菌RN4220 表現する mCherry 蛍光タンパク質 (S の黄色ブドウ球菌- mCherry)、別黄色ブドウ球菌株10,31の他の場所で説明されているように建設されたを使用しました。トランスジェニックゼブラフィッシュ ライン (mpeg1: UA/楓) 楓、マクロファージ32青蛍光ポリスチレン微小球に緑色蛍光タンパク質を用いて表現します。以前の研究では、生体材料の注入を模倣するゼブラフィッシュ胚微粒子の筋肉内注射が可能な33を示しました。蛍光強度を数値化する「ObjectJ」(ImageJ のプラグイン) 内で運営されている「ゼブラフィッシュ Immunotest」プロジェクト ファイルを用いて BAI の進行と時間をかけて単一胚に関連する細胞浸潤を定量的に解析、存在する細菌や微粒子33の注射部位周辺に浸潤したマクロファージ。さらに、我々 はコロニー形成の数字を決定した単位 (CFU) 胚における微粒子の有無における細菌の潜在的な感染症に及ぼす生体材料を研究します。本研究は、ここで開発した方法、ゼブラフィッシュ胚は体内の生体材料関連感染症を研究するため、有望な新規脊椎動物のモデルを示しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic soya agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>236950</td>
			<td>Media preparation unit at AMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soya broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2259.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)</td>
			<td>Life technology/ThemoFisher</td>
			<td>F8829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller instrument</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>Flaming p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope LM 20</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG33 10450123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose MP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope LM80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG3610450126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator M3301 with M10 stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>00-42-101-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5248ZO100329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtrube 2ml pp</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.693.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia beads</td>
			<td>Bio-connect</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA lyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td>41416401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>43671</td>
			<td>Chapmon 2 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MO512-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gyrotory shaker (for bacterial growth)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Incu-line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich-Zentrifugen</td>
			<td>ROTANTA 460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Pharmacia biotech</td>
			<td>Ultrospec&#174;2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>NL-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad 7.0</td>
			<td>Prism</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection

生体材料関連感染 (BAI) は、バイオマテリアル ・医療デバイスの障害の主要な原因です。黄色ブドウ球菌は、白の主要な病原体のひとつです。現在実験 BAI 哺乳類動物モデル マウス モデルは、コストと時間がかかり、したがってハイスループット解析には適していないようです。したがって、体内の白を調査するための補完的なシステムとして新しい動物モデルが望まれます。本研究では、生体内可視化と蛍光顕微鏡による生体材料の存在下で細菌感染症の生体内解析のためのゼブラフィッシュ胚モデルの開発を目指しました。また、誘発マクロファージの応答を調べた。このため、我々 は蛍光蛋白質を表現する黄色ブドウ球菌や、マクロファージの蛍光蛋白質を表現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を使用して細菌単独で、または一緒に微粒子を筋肉に注入する手順を考案胚の組織。時間をかけてライブ胚における細菌感染症の進行を監視するため蛍光細菌の顕微鏡による得点のシンプルだが信頼性の高い方法を考案しました。顕微鏡得点から結果は細菌の以上 20 コロニー形成単位 (CFU) を持つすべての胚が細菌の肯定的な蛍光シグナルを得られました。感染に対する生体材料の潜在的な影響を研究するには、我々 は胚のモデル材料として 10 μ m のポリスチレン微小球 (10PS) と黄色ブドウ球菌の CFU の数字を決定しました。また、時間の経過とともに黄色ブドウ球菌感染症 PS10との蛍光強度を定量化するのに ObjectJ プロジェクト ファイル ImageJ で「ゼブラフィッシュ Immunotest」を使用。両方の方法からの結果は、微粒子、生体材料の存在下で増加感染感受性を示すことがなく胚よりも微粒子で感染した胚で黄色ブドウ球菌の高い数字を示した。したがって、本研究は、ここで開発された手法により研究して白にゼブラフィッシュ胚の可能性を示しています。

本研究は、生体材料関連感染を調査するため、新たな脊椎動物モデルとしてのゼブラフィッシュ胚の適用性を評価しました。マイクロインジェクション法は細菌種を注入させる感染症22,26,27,30,36ゼブラフィッシュ胚によく使用されています。<stron...

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A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

ゼブラフィッシュ胚モデルにおける生体内可視化と生体材料の生体解析黄色ブドウ球菌感染症

本研究では、生体内可視化と蛍光顕微鏡を基バイオマテリアル関連感染の生体内解析のためのゼブラフィッシュ胚モデルについて説明します。このモデルは、生体内での生体関連感染症を研究するためマウス モデルなど哺乳類の動物モデルを補完する有望なシステムです。

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

この方法は、生体物質が感染に対する感受性にどのような影響を与えるか、それらがそのような感染症の進行にどのような影響を与えるか、そしてそれらが生体内でのそのような生体物質の周りの免疫細胞の挙動にどのような影響を与えるかについての重要な質問に答える助けになる。この技術の主な利点は、生体内の視覚化と生体物質関連感染症の生体内分析を可能にする新しい動物モデルを提供することです。生体物質微小球の注入は非常に繊細な手順であるため、この方法の視覚的実証は重要です。細菌のみの懸濁液を生成するには、最初に蛍光ステープルアウレウスmCherry株の4〜5コロニーを移し、クロラムフェニコール1ミリリットル当たり10マイクログラムを補充したトリプティック大豆農業プレートで培養し、クロラムフェニコールを補ったトリプティック大豆スープ10ミリリットルに培養し、37度で中二類期成長期の成長のために。培養液が620ナノメートルの0.4~0.8で光学濃度測定に達したら、遠心分離で菌を採取し、1回の洗浄につき1ミリリットルの滅菌PBSで細胞を2回洗浄する。2回目の洗浄後、ペレットを1.1ミリリットルのPVPで再懸濁し、再び光学濃度を測定する前に細菌懸濁液をボルテックスする。次に、実験要件に従ってPVPで細菌懸濁液の濃度を調整し、細菌のみの懸濁液を生成する。細菌微小球懸濁液を生成するために、遠心分離物市販のポリスチレン微小球、PS−10、及び細菌のみの懸濁液中の微小球ペレットを再懸濁させる。細菌のみの懸濁液の約2/3である懸濁液中の細菌の適切な濃度に達するためにPVPの1/2容量で細菌微小球懸濁液を希釈します。ボルテックスで懸濁液を混ぜます。細菌のみのと細菌の微小球懸濁液の濃度を確認するには、各懸濁液の100マイクロリットルを96ウェルプレートの個々のウェルに加えます。その後のウェルで90マイクロリットルの無菌PBS中の懸濁液の10マイクロリットルのアリコートを連続して希釈し、各希釈工程に新鮮な先端を使用する。希釈されていない細菌懸濁液の10マイクロリットルのアリコートを寒天プレートに適用し、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、コロニーを数えて、調製された細菌のみの細菌および細菌の微小球懸濁液内の細菌の数を計算する。ゼブラフィッシュ胚を採取した後、透明でない非生存可能な胚を捨て、新鮮なE3培地で摂氏28度で100ミリリットルのペトリ皿あたり約60個の胚をインキュベートする。麻酔後、蛍光顕微鏡用GFP陽性胚を隔離する。E3培地の100ミリリットルのペトリ皿に移します。射出型を作成するには、100ミリリットルのペトリ皿に1〜1.5%の液体アガロースを充填します。プラスチックモールドテンプレートを使用して、アガロースに溝を作成します。アガロースが固まったら、金型を取り除き、0.02%トリカインを添加したE3培地で寒天を覆います。1日3回の受精後、引っ張られたガラスのマイクロキャピラリー針の先端を壊すために鉗子を使用して、眼のスケールバーを持つ光顕微鏡下で約20マイクロメートルの外径の先端を達成する。針先の開口部の調整は、微小球の注入に実用的である。開口部の直径は、異なるサイズの微小球に合わせて調整する必要があります。次に、マイクロローダーのピペットチップを使用して、細菌のマイクロスフィアまたは細菌のみの懸濁液の約20マイクロリットルで針をロードし、マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレータに針を取り付けます。今、溝状のアガロースプレートに選択した胚を転送します。胚が麻酔されるまで5分待った後、その注射のための単一の向きに溝の中の胚を整列させる。マイクロインジェクターを適切な注射設定に設定し、ステレオ顕微鏡下で第1の胚の筋肉組織に45〜60度の角度で針を挿入する。必要に応じて針を前後にそっと動かして組織内の位置を調整し、マイクロインジェクターフットペダルを使用してロードされたサスペンションを注入します。ゼブラフィッシュ胚の組織に細菌微小球懸濁液を注入する場合、針は穏やかに挿入されるべきであるが、安定した手で。挿入が成功した後、射出前に材料用のスペースを作成する必要があります。すべての胚が注入されたら、ステレオ蛍光顕微鏡下で正常に注射するために胚をスコアし、毎日の培地変化を伴う48ウェルプレートの個々のウェルにトリケインなしでE3培地の胚を維持する。コロニー形成ユニット定量による感染進行を監視するために、注射直後に5〜6個の生存可能な感染胚を個々の2ミリリットルマイクロチューブに無作為に移し、胚を滅菌PBSで穏やかに洗浄する。各チューブに100マイクロリットルの無菌PBSを加え、続いて2~3個の無菌2ミリメートル径ジルコニアビーズを加えます。次に、3、500rpmでホモジナイザーで胚を30秒間粉砕し、実演したようにホモゲネートを培養する。ステレオ蛍光顕微鏡ステージに0.02%トリケーヌを添加したE3培地を含む100ミリメートルのペトリ皿を置き、ペトリ皿に2%メチルセルロースの500マイクロリットルを加えます。蛍光顕微鏡による感染の進行を監視するには、適切な明視野フィルターと蛍光フィルターを装備し、ペトリ皿のメチルセルロースのスポットに麻酔を付けた感染した胚を水平に整列させます。明視野フィルターを使用して、損傷した注入された組織を160倍の倍率で焦点にします。Zスタック深度を10マイクロメートルに、ステップサイズを5マイクロメートルに設定して、3つの連続した画像を記録できるようにします。その後、160倍の拡大で同一の最適化された設定で個々の胚を画像化します。ImageJ の ObjectJ プラグインを使用して、イメージを分析します。ステープルアウレウスの筋肉内注射は、胚における用量依存性感染を開始し、胚で観察される生存可能な感染進行は、注射後1日目と2日目に高挑戦用量を投与した。実証されるように、微小球の存在下または存在しない場合に同様の数の細菌を注入することができる。典型的には、20以上のコロニー形成ユニットを有する全ての胚は、微視的スコアリング下で蛍光に陽性であるが、微小球の存在は低用量の挑戦的な胚における感染進行に有意に影響を及ぼさないようだ。高寄剤の挑戦的胚では、微小採点は微小球の有無にかかわらず感染した胚頻度の違いを示さないが、定量的培養は、注射後2日にステープルアウレウスのみの群から採取されたものと比較して、ステープルアウレウスプラス微小球群の胚から取り出されたより高いコロニー形成ユニット数を明らかにする。生体材料の存在は、免疫細胞応答と感染に対する初期の感受性の両方に影響を与える。例えば、注射後5時間で、ステープルアウレウスのみの注射に応答するマクロファージ浸潤は、ステープルアウレウスと微小球注射に応答するよりも有意に高く、注射後のある日では、微小球を有する胚は微小球のない胚よりも有意に高いレベルのステープルアウレウス感染を示す。常に生体材料の大きさに針先の開口部を調整し、細菌のみの懸濁液と細菌の微小球懸濁液中の細菌濃度の比率を調整することを忘れないでください。このゼブラフィッシュ胚モデルは、生体物質の存在下および存在しない中での感染進行および誘発された免疫細胞応答のインビボ視覚化およびインビタル分析を可能にする。この技術は、抗菌バイオマテリアルの開発と安全な医療機器の治療戦略のための新しい全動物モデルを提供します。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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