Name: a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

Este estudo foi financeiramente apoiado pelo projecto IBIZA do programa materiais biomédicos (BMM) e co-financiado pelo Ministério dos assuntos económicos. Os autores gostaria de agradecer a Prof. Dr. Graham Lieschke da Universidade de Monash, Austrália para fornecer a linha de zebrafish transgênicos (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Neste protocolo, manutenção de zebrafish adulto é em conformidade com os regulamentos locais de bem-estar animal como aprovado pelo Comitê de bem-estar animal local. Foram realizados experimentos com embriões de acordo com a Directiva 2010/63/UE.
1. preparação de "bactérias" e somente as suspensões de bactérias-microesferas
Nota: A tensão de RN4220 de S. aureus expressando a proteína fluorescente mCherry (S. aureus- mCher...

Infecção associada biomaterial (BAI) é uma complicação clínica grave. Uma melhor compreensão da patogênese de BAI em vivo proporcionaria novas ideias para melhorar a prevenção e tratamento do BAI. No entanto, atual BAI animais modelos experimentais tais como modelos de murino são caro, trabalhoso e exigem pessoal especializado treinado em técnicas cirúrgicas complexas. Portanto, estes modelos não são adequados para análise de alto rendimento. Desde que os requisitos para os modelos de embrião de zebrafis...

Uma variedade de dispositivos médicos (referido como "biomateriais") são cada vez mais utilizados na medicina moderna para restaurar ou substituir as partes de corpo humano1. No entanto, a implantação de biomateriais predispõe um paciente à infecção, chamada uma infecção associada biomaterial (BAI), que é uma grande complicação dos implantes em cirurgia. Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis são duas espécies bacterianas mais prevalentes responsáveis por BAI2,3,4,5,6. Implantou a forma de biomateriais uma superfície suscetível à formação de biofilme bacteriano. Além disso, resposta imune local pode ser perturbada pelos biomateriais implantados, causando reduzida eficácia do apuramento bacteriana. A autorização inicial de infectar bactérias é realizada principalmente por infiltração de neutrófilos, fortemente reduzida capacidade bactericida na presença de um inserido ou implantado biomaterial7. Além disso, os macrófagos infiltrando o tecido após o fluxo inicial de neutrófilos será fagocitam as bactérias restantes, mas não pode efetivamente matá-los intracelular, devido a demente imunológico sinalizando que é uma consequência da presença combinada de o biomaterial e bactérias8. Assim, a presença de biomateriais pode facilitar a sobrevivência intracelular de bactérias9,10,11,12,13 e biofilme formação sobre o implantado biomateriais4,14. Consequentemente, BAI pode levar ao fracasso e a necessidade de substituição de biomateriais implantados, causando aumento de morbilidade e mortalidade e hospitalização prolongada com custos adicionais2,15.
Um número crescente de estratégias anti-BAI está sendo desenvolvidos2,16,17. Avaliação in vivo da eficácia destas estratégias em modelos animais relevantes é essencial. No entanto, a tradicional BAI animais modelos experimentais (por exemplo, modelos de rato, ) são geralmente caro, demorado e, portanto, não é adequado para testar a alta taxa de transferência de múltiplas estratégias18. O desenvolvimento recente de técnicas bio-óptico de imagem baseado em bioluminescentes/fluorescente rotular de bactérias e células hospedeiras pode permitir o monitoramento contínuo das interações hospedeiro-patógeno/hospedeiro-material e progressão de BAI em único pequenos animais como ratos18,19,20,21. No entanto, esta técnica é relativamente complexa e ainda em sua infância, e várias questões devem ser resolvidas para análise quantitativa de BAI18. Por exemplo, uma dose de alto desafio é necessário para visualizar a colonização bacteriana. Além disso, a luz espalhamento e adsorção de bioluminescência/fluorescência sinais em tecidos de mamíferos teste os animais também devem ser abordadas de19,18,21. Portanto, novo, cost-effective modelos animais, permitindo a visualização intravital e análise quantitativa ao longo do tempo são valiosos sistemas complementares para o estudo in vivo do BAI.
Zebrafish (embriões) têm sido usados como uma ferramenta versátil em vivo para dissecar as interações patógeno-hospedeiro e patogênese da infecção de diversas espécies bacterianas como micobactérias22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, estafilococose Enterococcus faecalis2526,27. Zebrafish embriões têm muitas vantagens tais como a transparência óptica, um relativamente baixo custo de manutenção e a posse de um sistema imune altamente similar em mamíferos28,29. Isto torna o zebrafish embriões um organismo modelo altamente econômico, vivendo para visualização intravital e análise da progressão da infecção e hospedeiro associados respostas28,29. Para permitir a visualização do comportamento de célula zebrafish transgênicos, vivo em linhas com diferentes tipos de células do sistema imunológico (por exemplo,, de macrófagos e neutrófilos) e até mesmo com estruturas subcelulares fluorescente etiquetadas foram desenvolvidos28 ,29. Além disso, a taxa de reprodução alta de zebrafish fornece a possibilidade de desenvolver sistemas de teste de alto rendimento com injeção robótica automatizada, quantificação de fluorescência automatizada e de análise de sequência de RNA27, 30.
No presente estudo, objetivou-se desenvolver um modelo de embrião de zebrafish para infecção associada biomaterial, usando técnicas da imagem latente de fluorescência. Para este fim, nós desenvolvemos um procedimento para injetar bactérias (S. aureus) na presença de microesferas de biomaterial no tecido muscular de embriões de peixe-zebra. Usamos o S. aureus RN4220 expressando mCherry proteína fluorescente (s. aureus- mCherry), que foi construída conforme descrito em outro lugar para S. aureus outra estirpe de10,31. A linha de zebrafish transgênicos (mpeg1: UAS/Kaede) expressando Kaede proteína verde fluorescente nos macrófagos32 e azul fluorescente poliestireno microesferas foram usados. Em um estudo anterior, mostramos que a injeção intramuscular de microesferas em embriões de peixe-zebra para imitar o implante do biomaterial é viável33. Para analisar quantitativamente a progressão de BAI e infiltração de célula associada em embriões única ao longo do tempo, usamos o arquivo de projeto "Zebrafish-Immunotest", que é operado dentro de "ObjectJ" (um plug-in para ImageJ) para quantificar a intensidade da fluorescência de as bactérias que residem e macrófagos, infiltrando-se nas proximidades do local da injeção de microesferas33. Além disso, nós determinamos os números de formadoras de Colônia (UFC) de unidades de bactérias na presença e na ausência de microesferas nos embriões para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na infecção. Nosso presente estudo demonstra que, com os métodos desenvolvidos aqui, o embrião de zebrafish é promissor, a novo vertebrado modelo animal para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic soya agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>236950</td>
			<td>Media preparation unit at AMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soya broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2259.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)</td>
			<td>Life technology/ThemoFisher</td>
			<td>F8829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller instrument</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>Flaming p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope LM 20</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG33 10450123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose MP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope LM80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG3610450126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator M3301 with M10 stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>00-42-101-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5248ZO100329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtrube 2ml pp</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.693.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia beads</td>
			<td>Bio-connect</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA lyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td>41416401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>43671</td>
			<td>Chapmon 2 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MO512-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gyrotory shaker (for bacterial growth)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Incu-line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich-Zentrifugen</td>
			<td>ROTANTA 460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Pharmacia biotech</td>
			<td>Ultrospec&#174;2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>NL-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad 7.0</td>
			<td>Prism</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection

Infecção associada biomaterial (BAI) é das principais causas do fracasso de biomateriais/dispositivos médicos. Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos em BAI. Atual animal experimental de mamíferos BAI modelos tais como modelos de mouse são dispendiosos e demorados e, portanto, não é adequado para análise de alto rendimento. Assim, novos modelos animais como sistemas complementares para investigar BAI in vivo são desejados. No presente estudo, visamos desenvolver um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção bacteriana na presença de biomateriais baseado em microscopia de fluorescência. Além disso, estudou-se a resposta de macrófagos provocado. Para este fim, usamos de expressar a proteína fluorescente S. aureus e embriões de zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes em seus macrófagos e desenvolveu um procedimento para injetar o músculo bactérias sozinhos ou em conjunto com microesferas tecido de embriões. Para monitorar a progressão da infecção bacteriana em embriões ao vivo ao longo do tempo, criámos um método simples mas confiável de marcar microscópica de bactérias fluorescentes. Os resultados de marcar microscópica mostraram que todos os embriões com mais de 20 unidades de formadoras de Colônia (UFC) de bactérias produziram um positivo sinal fluorescente de bactérias. Para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na infecção, determinamos os números CFU de S. aureus com e sem 10 µm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriais modelo nos embriões. Além disso, usamos o arquivo de projeto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" operando em ImageJ para quantificar a intensidade de fluorescência da infecção por S. aureus com e sem PS10 ao longo do tempo. Os resultados de ambos os métodos mostraram números mais altos de S. aureus em embriões infectados com microesferas que em embriões sem microesferas, indicando uma susceptibilidade aumentada infecção na presença do biomaterial. Assim, o presente estudo mostra o potencial do modelo de embrião de peixe-zebra para estudar BAI com os métodos desenvolvidos aqui.

O presente estudo avaliou a aplicabilidade do zebrafish embriões de novela modelo animal vertebrado para investigar infecção associada biomaterial. Técnica de microinjeção tem sido comumente usada para injetar diferentes espécies bacterianas em embriões de peixe-zebra para causar infecção22,26,,27,30,36. Usando o proc...

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A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

O presente estudo descreve um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção biomaterial associada ao longo do tempo com base em microscopia de fluorescência. Este modelo é um sistema promissor complementando modelos animais mamíferos, tais como modelos de rato para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como os biomateriais influenciam a suscetibilidade à infecção, como eles influenciam a progressão dessas infecções e como afetam o comportamento das células imunes em torno desses biomateriais in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um novo modelo animal que permite visualização in vivo e análise intravital de infecções associadas a biomateriais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a injeção de microesferas biomaterial é um procedimento muito delicado.Para gerar uma suspensão somente de bactérias, primeiro transfira quatro a cinco colônias da cepa fluorescente Staph aureus mCherry, cultivada em placas de agricultura de soja trippética suplementadas com 10 microgramas por mililitro de clorofenicol em 10 mililitros de caldo de soja tripptic complementado com clororamfenicol, para crescimento na fase de crescimento logarítmico médio em 37 graus Celsius com agitação. Quando a cultura atinge uma medição de densidade óptica a 620 nanômetros de 0,4 a 0,8, colete as bactérias por centrifugação e lave as células duas vezes com um mililitro de PBS estéril por lavagem. Após a segunda lavagem, resuspenja a pelota em 1,1 mililitros de PVP, e vórtice a suspensão bacteriana antes de medir novamente a densidade óptica.Em seguida, ajuste a concentração da suspensão bacteriana com PVP de acordo com os requisitos experimentais para gerar a suspensão somente de bactérias. Para gerar uma suspensão da microesfera de bactérias, centrífuga microesferas comerciais de poliestireno, PS-10, e resuspensar a pelota da microesfera na suspensão somente de bactérias. Diluir a suspensão da microesfera da bactéria com um volume de 1/2 de PVP para atingir uma concentração adequada de bactérias na suspensão que é aproximadamente 2/3 disso na suspensão somente de bactérias.Misture a suspensão por vórtice. Para verificar a concentração da suspensão da microesfera somente de bactérias e bactérias, adicione 100 microliters de cada suspensão a poços individuais de uma placa de 96 poços. Diluir em série 10 alíquotas de microliter das suspensões em 90 microliters de PBS estéreis em poços subsequentes, usando novas pontas para cada etapa de diluição.Aplique alíquotas duplicadas de 10 microliter das suspensões bacterianas não diluídas e diluídas em placas de ágar, e incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, conte as colônias para calcular o número de bactérias dentro das suspensões de microesferas preparadas por bactérias e bactérias. Depois de coletar os embriões de zebrafish, descarte quaisquer embriões inviáveis não transparentes e incubar aproximadamente 60 embriões por placa petri de 100 mililitros a 28 graus Celsius em meio E3 fresco.Após anestesia, sequetre os embriões GFP positivos para microscopia de fluorescência. Transfira-os para uma placa petri de 100 mililitros de meio E3. Para criar um molde de injeção, encha uma placa de Petri de 100 mililitros com uma agarose líquida de 1 a 1,5%.Use um modelo de molde de plástico para criar ranhuras na ágarose. Quando a agarose tiver solidificado, remova o molde e cubra o ágar com e3 médio suplementado com 0,02%tricina. Um dia três pós-fertilização, use fórceps para quebrar a ponta de uma agulha microcapilar de vidro puxada para obter pontas com um diâmetro externo de aproximadamente 20 micrômetros sob um microscópio leve com uma barra de escala no ocular.O ajuste da abertura da ponta da agulha é prático para a injeção de microesferas. O diâmetro da abertura precisa ser ajustado para microesferas de diferentes tamanhos. Em seguida, use uma ponta de pipeta microcarregador para carregar a agulha com aproximadamente 20 microliters da microesfera da bactéria ou suspensão somente de bactérias, e montar a agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor.Agora transfira os embriões selecionados para a placa de agarose ranhurada. Depois de esperar cinco minutos para que os embriões sejam anestesiados, alinhe os embriões dentro das ranhuras em uma única orientação para sua injeção. Coloque o microinjetor nas configurações de injeção apropriadas e insira a agulha no tecido muscular do primeiro embrião em um ângulo de 45 a 60 graus sob um microscópio estéreo.Mova suavemente a agulha para frente e para trás para ajustar a posição dentro do tecido conforme necessário, e use o pedal do pé microinjetor para injetar a suspensão carregada. Ao injetar uma suspensão da microesfera de bactérias no tecido de embriões de zebrafish, a agulha deve ser inserida suavemente, mas com uma mão firme. Após uma inserção bem sucedida, um espaço deve ser criado para os materiais antes da injeção.Quando todos os embriões forem injetados, marque os embriões para uma injeção bem sucedida sob um microscópio de fluorescência estéreo, e mantenha os embriões no meio E3 sem tricaine em poços individuais de 48 placas de 48 poços com alterações médias diárias. Para monitorar a progressão da infecção por quantificação de unidade formadora de colônias, transfira aleatoriamente cinco a seis embriões infectados viáveis em microtubos individuais de dois mililitros logo após a injeção, e lave suavemente os embriões com PBS estéril. Após descartar as lavagens, adicione 100 microlitadores de PBS estéreis a cada tubo, seguido por duas a três contas de zircônia estéreis de dois milímetros de diâmetro.Em seguida, esmague os embriões em um homogeneizador a 3.500 rpm por 30 segundos, e cultural o homogeneizar como demonstrado. Coloque uma placa de Petri de 100 milímetros contendo e3 médio suplementado com 0,02% de tricaine em um estágio de microscópio de fluorescência estéreo, e adicione 500 microlitros de 2%de metilcelulose na placa de Petri. Para monitorar o progresso da infecção por microscopia de fluorescência, equipar os filtros de campo brilhante e fluorescentes apropriados, alinhe os embriões infectados anestesiados horizontalmente em uma mancha de metilcelulose em uma placa de Petri.Use o filtro de campo brilhante para colocar o tecido injetado danificado em foco em uma ampliação de 160x. Ajuste a profundidade da pilha Z em 10 micrômetros e o tamanho da etapa em cinco micrômetros para permitir a gravação de três imagens consecutivas. Em seguida, imagem os embriões individuais em configurações otimizadas idênticas em uma ampliação de 160x.Use o plugin ObjectJ no ImageJ para analisar as imagens. A injeção intramuscular de Staph aureus inicia uma infecção dependente de dose em embriões, com progressão viável de infecção observada em embriões administrados doses de alto desafio nos dias um e dois pós-injeção. Como demonstrado, é possível injetar números semelhantes de bactérias na presença ou ausência de microesferas.Normalmente, todos os embriões com mais de 20 unidades formadoras de colônias de Staph aureus mCherry são positivos para fluorescência sob pontuação microscópica, embora a presença de microesferas pareça não influenciar significativamente a progressão da infecção nos embriões desafiados de baixa dose. Em embriões desafiados de alta dosagem, a pontuação microscópica não demonstra diferenças na frequência de embriões infectados com ou sem microesferas, mas a cultura quantitativa revela maior número de unidades formadoras de colônias recuperadas de embriões no grupo Staph aureus plus microesfera em comparação com os colhidos do grupo só de Staph aureus em dois dias após a injeção. A presença de um bioma material influencia tanto a resposta das células imunes quanto a suscetibilidade inicial à infecção.Por exemplo, em cinco horas após a injeção, a infiltração do macrófago em resposta a uma injeção só de staph aureus é significativamente maior do que em resposta a uma injeção de estafa mais microesferas, enquanto em um dia pós-injeção, os embriões com microesferas exibem níveis significativamente mais altos de infecção por Estafilococos do que os embriões sem microesferas. É importante lembrar sempre ajustar a abertura da ponta da agulha para o tamanho dos biomateriais e ajustar a proporção da concentração de bactérias na suspensão somente de bactérias e suspensão da microesfera das bactérias. Este modelo de embrião de zebrafish permite a visualização in vivo e a análise intravital da progressão da infecção e as respostas provocadas das células imunes na presença e ausência de biomateriais.Esta técnica fornece um novo modelo de animais inteiros para o desenvolvimento de biomateriais antimicrobianos e estratégias de tratamento para dispositivos médicos seguros.

Research

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Bioengineering

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