Name: a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por el proyecto de IBIZA del programa biomédico Material (BMM) financieramente y cofinanciado por el Ministerio holandés de asuntos económicos. Los autores desean agradecer Prof. Dr. Graham Lieschke de Monash University, Australia para proporcionar la línea de pez cebra transgénico (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

En este protocolo, mantenimiento del pez cebra adulto es conforme a las normas locales de bienestar animal aprobado por el Comité de bienestar de los animales locales. Se realizaron experimentos con embriones según la Directiva 2010/63/UE.
1. preparación de ""las bacterias-sólo y suspensiones de microesferas de bacterias
Nota: Se utiliza la cepa de S. aureus RN4220 expresan la proteína fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry). ...

Infecciones asociadas a biomateriales (BAI) es una complicación clínica grave. Una mejor comprensión de la patogenesia del BAI en vivo ofrecería nuevas ideas para mejorar la prevención y tratamiento de BAI. Sin embargo, experimental BAI animales modelos actuales como modelos murinos son costosos, que requieren mucho trabajo y requieren personal especializado entrenado en las técnicas quirúrgicas complejas. Por lo tanto, estos modelos no son adecuados para el análisis de alto rendimiento. Requisitos para modelos d...

Una variedad de dispositivos médicos (que se refiere como "biomateriales") se utilizan cada vez más en la medicina moderna para restaurar o reemplazar partes del cuerpo humano1. Sin embargo, la implantación de biomateriales predispone a un paciente a la infección, llamada una infecciones asociadas a biomateriales (BAI), que es una importante complicación de implantes en cirugía. Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis son dos especies bacterianas más frecuentes responsables de BAI2,3,4,5,6. Implantado de forma de biomateriales una superficie susceptible a la formación de biopelículas bacterianas. Por otra parte, respuesta inmune local puede ser trastornada por los biomateriales implantados, que reducirá la eficacia de remoción bacteriana. La separación inicial de infectar a las bacterias se realiza principalmente por infiltración de neutrófilos, que han fuertemente reducido capacidad bactericida en presencia de un insertado o implantan biomaterial7. Por otra parte, los macrófagos que infiltran el tejido después de la llegada inicial de neutrófilos a fagocitar las bacterias restantes pero no efectivamente matan intracelularmente, por desquiciados inmune señalando que es una consecuencia de la presencia combinada de el biomaterial y bacterias8. Así, la presencia de biomateriales puede facilitar la supervivencia intracelular de bacterias9,10,11,12,13 y biofilm formación en los implantados Biomateriales4,14. En consecuencia, BAI puede llevar a la insuficiencia y necesidad de reemplazo de biomateriales implantados, causando aumento de la morbilidad y la mortalidad y la hospitalización prolongada con costes adicionales2,15.
Un número creciente de estrategias anti-BAI está siendo desarrollados2,16,17. Evaluación in vivo de la eficacia de estas estrategias en los modelos animales relevantes es esencial. Sin embargo, tradicional BAI animales modelos experimentales (e.g. modelos del ratón de, ) son generalmente costosos, desperdiciadores de tiempo y por lo tanto no es adecuado para las pruebas de alto rendimiento de múltiples estrategias18. Desarrollo reciente de técnicas de imagen bio-óptico basado en etiquetado fluorescente bioluminiscente de las bacterias y las células del huésped puede permitir el monitoreo continuo de las interacciones de progresión y huésped-patógeno-host-material BAI en solo animales pequeños como ratones18,19,20,21. Sin embargo, esta técnica es relativamente compleja y aún en su infancia, y se deben abordar varios temas para el análisis cuantitativo de BAI18. Por ejemplo, una dosis de desafío alta es necesaria para visualizar la colonización bacteriana. Además, la luz dispersa y adsorción de bioluminiscencia/fluorescencia señales en tejidos de mamífero prueba animales también deben ser abordados18,19,21. Por lo tanto, modelos animales novedosos y rentables permitiendo la visualización intravital y análisis cuantitativo en el tiempo son valiosos sistemas complementarios para el estudio in vivo de BAI.
Pez cebra (embriones) se han utilizado como una herramienta versátil en vivo para disección huésped-patógeno y patogenia de la infección de varias especies bacterianas como micobacterias22, aeruginosa de los Pseudomonas23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25y estafilococos26,27. Embriones de pez cebra tienen muchas ventajas tales como transparencia óptica, un relativamente bajo coste de mantenimiento y de posesión de un sistema inmune muy similar a la de mamíferos28,29. Esto hace que los embriones de pez cebra un organismo modelo muy económico, vivir para intravital visualización y análisis de la progresión de la infección y host asociado respuestas28,29. Para permitir la visualización del comportamiento de la célula líneas de pez cebra transgénico, en vivo con diferentes tipos de células inmunes (por ejemplo,, los macrófagos y neutrófilos) e incluso con estructuras subcelulares fluorescencia de etiquetado han sido desarrollado28 ,29. Además, la tasa alta de reproducción del pez cebra ofrece la posibilidad de desarrollar sistemas de prueba de alto rendimiento con inyección robótica automatizada, cuantificación de fluorescencia automatizada y RNA secuencia análisis27, 30.
En el presente estudio, el objetivo fue desarrollar un modelo de embrión de pez cebra para infecciones asociadas a biomateriales usando técnicas de imágenes de fluorescencia. Para ello, hemos desarrollado un procedimiento para inyectar bacterias (S. aureus) en presencia de microesferas de biomaterial en el tejido muscular de los embriones de pez cebra. Utilizamos S. aureus RN4220 expresando mCherry proteína fluorescente (S. aureus- mCherry), que fue construida como se describe en otra parte de otra cepa de S. aureus 10,31. La línea de pez cebra transgénico (mpeg1: UAS/Kaede) expresando Kaede se utilizaron proteína verde fluorescente en los macrófagos32 y azul fluorescente poliestireno microesferas. En un estudio previo, hemos demostrado que la inyección intramuscular de microesferas en embriones de pez cebra para imitar la implantación del biomaterial es factible33. Para analizar cuantitativamente la progresión de BAI y la infiltración de la célula asociada en embriones solo con el tiempo, se utilizó el archivo de proyecto "Pez cebra-Immunotest" que funciona dentro de "ObjectJ" (un plug-in para ImageJ) para cuantificar la intensidad de fluorescencia de las bacterias que residen y macrófagos infiltración en las cercanías del sitio de la inyección de microesferas33. Además, se determinó el número de la Colonia formando unidades (UFC) de bacterias en presencia y ausencia de microesferas en los embriones para estudiar posibles efectos de los biomateriales en la infección. El presente estudio demuestra que con los métodos desarrollados aquí, el embrión de pez cebra es un prometedor novela vertebrado animal modelo para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic soya agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>236950</td>
			<td>Media preparation unit at AMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soya broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2259.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)</td>
			<td>Life technology/ThemoFisher</td>
			<td>F8829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller instrument</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>Flaming p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope LM 20</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG33 10450123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose MP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope LM80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG3610450126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator M3301 with M10 stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>00-42-101-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5248ZO100329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtrube 2ml pp</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.693.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia beads</td>
			<td>Bio-connect</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA lyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td>41416401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>43671</td>
			<td>Chapmon 2 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MO512-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gyrotory shaker (for bacterial growth)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Incu-line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>759015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich-Zentrifugen</td>
			<td>ROTANTA 460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Pharmacia biotech</td>
			<td>Ultrospec&#174;2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well-plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>NL-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad 7.0</td>
			<td>Prism</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated staphylococcus aureus infection

Infecciones asociadas a biomateriales (BAI) es una causa importante del fracaso de los dispositivos médicos y biomateriales. Staphylococcus aureus es uno de los principales patógenos en BAI. Animal mamífero del BAI experimental actual modelos como modelos de ratón son costosos y desperdiciadores de tiempo y por lo tanto no es adecuado para el análisis de alto rendimiento. Por lo tanto, se desean que los nuevos modelos animales como sistemas complementarios para la investigación de BAI en vivo. En el presente estudio, el objetivo fue desarrollar un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infección bacteriana en presencia de biomateriales basados en la microscopía de fluorescencia. Además, se estudió la respuesta de macrófagos provocada. Para ello, utilizan fluorescentes expresando proteína de S. aureus y embriones de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en los macrófagos y desarrolló un procedimiento para inyectar bacterias solas o junto con microesferas en el músculo tejido de embriones. Para supervisar la progresión de la infección bacteriana en embriones vivos con el tiempo, ideamos un método simple pero confiable de puntuación microscópica de bacterias fluorescentes. Los resultados de puntuación microscópica demostraron que todos los embriones con más de 20 unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias dio como resultado una señal fluorescente positiva de las bacterias. Para estudiar los posibles efectos de los biomateriales en la infección, se determinó el número de UFC de S. aureus con y sin 10 μm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriales de modelo en los embriones. Por otra parte, se utilizó el archivo de proyecto ObjectJ "Pez cebra-Immunotest" en ImageJ para cuantificar la intensidad de fluorescencia de la infección de S. aureus con y sin PS10 con el tiempo. Resultados de ambos métodos mostraron mayor números de S. aureus en los embriones infectados con microesferas que en embriones sin microesferas, que indica una susceptibilidad creciente de la infección en presencia de biomaterial. Así, el presente estudio muestra el potencial del modelo de embrión de pez cebra para estudiar BAI con los métodos desarrollados aquí.

El presente estudio evaluó la aplicabilidad de los embriones de pez cebra como modelo animal vertebrado novela para investigar infecciones asociadas a biomateriales. Técnica de la microinyección se ha utilizado comúnmente para inyectar diferentes especies bacterianas en embriones de pez cebra para causar infección22,26,27,30,36<...

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A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

El presente estudio describe un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infecciones asociadas a biomateriales en el tiempo basado en microscopía de fluorescencia. Este modelo es un sistema prometedor complementando modelos animales mamíferos como los modelos de ratón para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los biomateriales influyen en la susceptibilidad a la infección, cómo influyen en la progresión de tales infecciones y cómo afectan el comportamiento de las células inmunitarias alrededor de estos biomateriales in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un nuevo modelo animal que permite la visualización in vivo y el análisis intravital de infecciones asociadas a biomateriales. La demostración visual de este método es fundamental ya que la inyección de microesferas biomateriales es un procedimiento muy delicado.Para generar una suspensión solo para bacterias, primero transfiera de cuatro a cinco colonias de la cepa fluorescente Staph aurery mCherry, cultivada en placas de cultivo de soja trípticas complementadas con 10 microgramos por mililitro de cloramphenicol en 10 mililitros de caldo de soja tríptico complementado con cloramphenicol, para el crecimiento en la fase de crecimiento medio logarítmico a 37 grados Celsius con temblor. Cuando el cultivo alcanza una medida de densidad óptica a 620 nanómetros de 0,4 a 0,8, recoger las bacterias por centrifugación, y lavar las células dos veces con un mililitro de PBS estéril por lavado. Después del segundo lavado, resuspender el pellet en 1,1 mililitros de PVP, y vórtice la suspensión bacteriana antes de medir la densidad óptica de nuevo.A continuación, ajuste la concentración de la suspensión bacteriana con PVP de acuerdo con los requisitos experimentales para generar la suspensión sólo bacteriana. Para generar una suspensión de microesfera bacteriana, centrifugar microesferas comerciales de poliestireno, PS-10, y resuspender el pellet de microesfera en la suspensión solo bacteriana. Diluir la suspensión de microesfera de la bacteria con un volumen de 1/2 de PVP para alcanzar una concentración adecuada de bacterias en la suspensión que es aproximadamente 2/3 de la que en la suspensión sólo por bacterias.Mezclar la suspensión por vórtice. Para comprobar la concentración de la suspensión de microesfera solo bacteriana y de bacterias, agregue 100 microlitros de cada suspensión a los pozos individuales de una placa de 96 pozos. Diluir en serie 10 microlitros alícuotas de las suspensiones en 90 microlitros de PBS estériles en pozos posteriores, utilizando puntas frescas para cada paso de dilución.Aplicar alícuotas duplicadas de 10 microlitros de las suspensiones bacterianas no diluidas y diluidas en las placas de agar, e incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, cuente las colonias para calcular el número de bacterias dentro de las suspensiones de microesferas de bacterias y solo preparadas. Después de recoger los embriones de pez cebra, deseche los embriones inviables no transparentes e incubar aproximadamente 60 embriones por plato de Petri de 100 mililitros a 28 grados centígrados en medio E3 fresco.Después de la anestesia, secuestre los embriones positivos de la GFP para la microscopía de fluorescencia. Transfiéralos a un plato Petri de 100 mililitros de medio E3. Para crear un molde de inyección, llene un plato de Petri de 100 mililitros con una agarosa líquida de uno a 1,5%.Utilice una plantilla de molde de plástico para crear ranuras en la agarosa. Cuando la agaria se haya solidificado, retire el molde y cubra el agar con medio E3 complementado con 0,02% de tricaína. Un día tres después de la fertilización, utilice fórceps para romper la punta de una aguja microcapilar de vidrio tirado para lograr puntas con un diámetro exterior de aproximadamente 20 micrómetros bajo un microscopio de luz con una barra de escala en el ocular.El ajuste de la abertura de la punta de la aguja es práctico para la inyección de microesferas. El diámetro de la abertura debe ajustarse para microesferas de diferentes tamaños. A continuación, utilice una punta de pipeta Microloader para cargar la aguja con aproximadamente 20 microlitros de la microesfera bacteriana o suspensión solo bacteriana, y monte la aguja en un micromaniprulador conectado a un microinyector.Ahora transfiera los embriones seleccionados a la placa de agarosa ranurada. Después de esperar cinco minutos para que los embriones sean anestesiados, alinee los embriones dentro de las ranuras en una sola orientación para su inyección. Ajuste el microinyector a los ajustes de inyección adecuados e inserte la aguja en el tejido muscular del primer embrión en un ángulo de 45 a 60 grados bajo un microscopio estéreo.Mueva suavemente la aguja hacia adelante y hacia atrás para ajustar la posición dentro del tejido según sea necesario, y utilice el pedal del microinyector para inyectar la suspensión cargada. Al inyectar una suspensión de microesfera bacteriana en el tejido de embriones de pez cebra, la aguja debe insertarse suavemente pero con una mano firme. Después de una inserción exitosa, se debe crear un espacio para los materiales antes de la inyección.Cuando se hayan inyectado todos los embriones, puntúe los embriones para una inyección exitosa bajo un microscopio de fluorescencia estéreo, y mantenga los embriones en medio E3 sin tricaína en pozos individuales de placas de 48 pozos con cambios medios diarios. Para monitorear la progresión de la infección mediante la cuantificación de la unidad formadora de colonias, transfiera aleatoriamente de cinco a seis embriones infectados viables a microtubos individuales de dos mililitros poco después de la inyección, y lave suavemente los embriones con PBS estéril. Después de desechar los lavados, agregue 100 microlitros de PBS estéril a cada tubo, seguido de dos a tres cuentas estériles de circonio de dos milímetros de diámetro.A continuación, aplastar los embriones en un homogeneizador a 3.500 rpm durante 30 segundos, y cultivar el homogeneización como se demuestra. Coloque un plato Petri de 100 milímetros que contenga un medio E3 complementado con 0,02% de tricaína en una etapa de microscopio de fluorescencia estéreo, y agregue 500 microlitros de 2% de metilcelulosa en la placa Petri. Para monitorear el progreso de la infección por microscopía de fluorescencia, equipar los filtros fluorescentes y de campo brillante apropiados, alinear los embriones infectados anestesiados horizontalmente en un punto de metilcelulosa en una placa Petri.Utilice el filtro de campo brillante para enfocar el tejido inyectado dañado en un aumento de 160x. Establezca la profundidad de la pila Z en 10 micrómetros y el tamaño del paso a cinco micrómetros para permitir la grabación de tres imágenes consecutivas. A continuación, imagine los embriones individuales bajo ajustes optimizados idénticos con un aumento de 160x.Utilice el plugin ObjectJ en ImageJ para analizar las imágenes. La inyección intramuscular de estafilococo inicia una infección dependiente de la dosis en embriones, con progresión de la infección viable observada en embriones administrados dosis de alto desafío en los días uno y dos después de la inyección. Como se ha demostrado, es posible inyectar un número similar de bacterias en presencia o ausencia de microesferas.Típicamente, todos los embriones con más de 20 unidades formadoras de colonias de Staph aureus mCherry son positivos para la fluorescencia bajo puntuación microscópica, aunque la presencia de microesferas parece no influir significativamente en la progresión de la infección en los embriones de dosis bajas cuestionados. En embriones con alto costo, la puntuación microscópica no demuestra ninguna diferencia en la frecuencia de embriones infectados con o sin microesferas, pero el cultivo cuantitativo revela números más altos de unidades formadoras de colonias recuperados de embriones en el grupo Staph aureus plus microsphere en comparación con los cosechados del grupo Staph aureus a los dos días posteriores a la inyección. La presencia de un biomaterial influye tanto en la respuesta de las células inmunitarias como en la susceptibilidad inicial a la infección.Por ejemplo, a las cinco horas después de la inyección, la infiltración de macrófagos en respuesta a una inyección sólo staf aureus es significativamente mayor que en respuesta a una inyección de Staph aureus más microesferas, mientras que en un día después de la inyección, los embriones con microesferas presentan niveles significativamente más altos de infección por Staph aureus que los embriones sin microesferas. Es importante recordar ajustar siempre la abertura de la punta de la aguja al tamaño de los biomateriales y ajustar la relación de la concentración de bacterias en la suspensión solo bacteriana y la suspensión de microesfera de las bacterias. Este modelo de embrión de pez cebra permite la visualización in vivo y el análisis intravital de la progresión de la infección y las respuestas de células inmunitarias provocadas en presencia y ausencia de biomateriales.Esta técnica proporciona un nuevo modelo de animales enteros para el desarrollo de biomateriales antimicrobianos y estrategias de tratamiento para dispositivos médicos seguros.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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