Name: methionine functionalized biocompatible block copolymers for targeted plasmid dna delivery
Uploaded: 2019-08-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door het National Key Research and Development Program van China (No. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation of China (NOS. 81801827, 81872365), basis onderzoeksprogramma van Jiangsu Province (Natural Science Foundation, No. BK20181086), en het Jiangsu Cancer Hospital wetenschappelijk onderzoek Fonds (nr. ZK201605).

1. synthese van BNHEMA polymeer (PBNHEMA)
<ol><li>Los 1,87 g n, n-bis(2-hydroxyethyl) METHACRYLAMIDE (bnhema) op in 1 ml gedistilleerd water in een polymerisatie fles. Opmerking: de polymerisatie fles is een rondbodemkolf met een rubberen stop en een magneetroerder.</li>
	<li>Los 0,03 g 4-cyanopentanoïnezuur dithiobenzoaat (CTP) en 0,02 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovalericzuur) (ACVA) op in 0,5 mL van 1,4-dioxaan in een bekerglas van 5 mL. Voeg vervolgens de CTP-en ACVA-oplossing toe aan de polymerisat...

<ol>
	<li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Cell+Therapy+in+2018:+A+Look+Ahead.">Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead.</a> Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine-based+combination+anticancer+therapy+between+nucleic+acids+and+small-molecular+drugs.">Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+of+multidrug+resistance+breast+cancer+by+co-delivery+of+P-gp+siRNA+and+doxorubicin+via+folic+acid-modified+core-shell+nanomicelles.">Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles.</a> Colloids &amp; Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).</li><li>Quader, S., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial-Enabled+Cancer+Therapy.">Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy.</a> Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+methionine-functionalized+biocompatible+block+copolymers+for+targeted+siRNA+delivery+and+subsequent+reversal+effect+on+adriamycin+resistance+in+human+breast+cancer+cell+line+MCF-7/ADR.">Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR.</a> Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).</li><li>Szwarc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=‘Living’+Polymers.">‘Living’ Polymers.</a> Nature. 178, 168-169 (1956).</li><li>Szwarc, M., Rembaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerization+of+methyl+methacrylate+initiated+by+an+electron+transfer+to+the+monomer.">Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer.</a> Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).</li><li>Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+supramolecular+polymerization.">Living supramolecular polymerization.</a> Science. 349, 241 (2015).</li><li>Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+preparation+of+poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay+nanocomposites+via+living+cationic+ring-opening+polymerization.">In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization.</a> European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).</li><li>Wu, W., Wang, W., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Star+polymers:+Advances+in+biomedical+applications.">Star polymers: Advances in biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).</li><li>Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Mediated+Living+Radical+Polymerization+(Atom+Transfer+Radical+Polymerization+and+Copper(0)+Mediated+Polymerization):+From+Fundamentals+to+Bioapplications.">Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications.</a> Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).</li><li>Keddie, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+the+synthesis+of+block+copolymers+using+reversible-addition+fragmentation+chain+transfer+(RAFT)+polymerization.">A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization.</a> Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinylated+3-gluconamidopropyl+methacrylamide-s-3-aminopropyl+methacrylamide+copolymer+as+siRNA+carriers+for+inhibiting+human+telomerase+reverse+transcriptase+expression.">Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression.</a> Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).</li><li>Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Guanidinated+N-3-Aminopropyl+Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl+Methacrylamide+Co-polymers+as+Gene+Delivery+Carrier.">Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).</li><li>Friedman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Ninhydrin+Reaction+for+Analysis+of+Amino+Acids,+Peptides,+and+Proteins+to+Agricultural+and+Biomedical+Sciences.">Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).</li><li>Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Cyclic+Polymers+and+Characterization+of+Their+Diffusive+Motion+in+the+Melt+State+at+the+Single+Molecule+Level.">Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).</li><li>Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Characterization+of+Individual+and+Multi-drug+Loaded+Physically+Entrapped+Polymeric+Micelles.">Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles.</a> Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).</li></ol>

Deze studie introduceerde een reeks BNHEMA-b-APMA blok polymeer cationische gendragers. Deze blok polymeren werden gesynthetiseerd via de omkeerbare addition-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) methode. Het hydrofiele segment BNHEMA werd geïntroduceerd om de oplosbaarheid te verbeteren. Methionine en guanidine groepen werden aangepast ter verbetering van het doelvermogen en transfectie efficiëntie5. De APMA-keten-inhoud verhoogd en guanidinylering in mBG copolymeer verminderde de deeltjesgrootte ...

In de afgelopen jaren is gentherapie ontstaan voor de therapeutische afgifte van nucleïnezuren als geneesmiddelen voor de behandeling van allerlei ziekten1. De ontwikkeling van gengenees middelen, waaronder plasmide DNA (pDNA) en klein interfererende RNA (siRNA), is afhankelijk van de stabiliteit en efficiëntie van het geneesmiddel bezorgingssysteem (DDS)2. Onder alle DDS, kationische polymeer dragers hebben de voordelen van goede stabiliteit, lage immunogeniciteit, en facile voorbereiding en modificatie, die kationische polymeer dragers brede toepassing prospects3,4geven. Voor praktische toepassingen in de biomedische, onderzoekers moeten een kationische Polymer Carrier met hoge efficiëntie te vinden, lage toxiciteit, en goede targeting vermogen5. Onder alle polymeer dragers, Block copolymeren zijn een van de meest gebruikte drug delivery systemen. Block copolymeren worden intensief bestudeerd voor hun zelf-assemblage eigendom en capaciteiten om micellen, microsferen en nanodeeltjes te vormen in de levering van geneesmiddelen5. Blok copolymeren kunnen worden gesynthetiseerd via levende polymerisatie of klik op scheikunde methoden.
In 1956, szwarc et al. verhoogde het onderwerp van levende polymerisatie, definiëren het als een reactie zonder keten-brekende reacties6,7. Sindsdien zijn er meerdere technieken ontwikkeld om polymeren te synthetiseren met behulp van deze methode; levende polymerisatie wordt dus gezien als een mijlpaal van polymeer wetenschappen8. Levende polymerisatie kan worden ingedeeld in levende anionische polymerisatie, levende cationische polymerisatie en omkeerbare deactivering radicale polymerisatie (RDRP)9. Levende anionische/kationische polymerisaties hebben een beperkt toepassingsgebied vanwege hun strenge reactieomstandigheden10. Gecontroleerd/levend radicaal polymerisatie (CRP) heeft milde reactieomstandigheden, handige dispositie, en goede opbrengst en is dus een belangrijke onderzoeksinfrastructuur geweest in de afgelopen jaren11. In CRP worden actieve propagatie ketens reversibel gepassiveerde tot slapende om de concentratie van vrije radicalen te verminderen en de bimoleculaire reactie van voortplantings keten radicalen te voorkomen. De additie polymerisatie kan alleen worden voortgezet als de inactieve teelt ketens omkeerbaar worden geanimeerd in keten radicalen. Als een van de meest veelbelovende vormen van levend radicaal polymerisatie, omkeerbare toevoeging-fragmentatie ketting overdracht (RAFT) polymerisatie is een methode die van toepassing is op het rendements blok polymeren met gecontroleerd moleculair gewicht en structuur, smal moleculair gewicht distributie en het meenemen van functionele groepen12. De sleutel tot succesvolle RAFT polymerisatie is het effect van keten Transfer agenten, meestal dithioesters, die zeer hoge keten overdracht constante bezitten.
In dit document is een RAFT-polymerisatie methode ontworpen om BNHEMA-b-APMA-blok-polymeer te bereiden, waarbij 4, 4 '-azobis (4-cyanovalerische zuur) (acva) als initiërende middel en 4-cyanopentanozuurdithiobenzoaat (CTP) als keten transfer agent wordt gebruikt. RAFT polymerisatie werd twee keer gebruikt om BNHEMA in de cationische polymeer dragers te introduceren. Vervolgens werden de amine groepen in de APMA-keten gemodificeerd met methionine en de guanidinylatie-reagens 1-amidinopyrazol hydrochloride. Door het gebruik van de positieve ladingen van het guanidinylatiereagens en de methacrylamide polymeerskelet structuur werd de cellulaire opname-efficiëntie van de verkregen blok polymeer dragers verbeterd.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>1-hydroxybenzotriazole</td>
<td>Macklin Biochemical Co., Ltd,China</td>
<td>H810970</td>
<td>&ge;97.0%</td>
</tr>
<tr>
<td>1,4-dioxane</td>
<td>Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China</td>
<td>10008918</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>1-amidinopyrazole Hydrochloride</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>A107935</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>E106172</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>4,4&#x2019;-azobis(4-cyanovaleric acid)</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>A106307</td>
<td>Analytical reagent (AR)</td>
</tr>
<tr>
<td>4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>C132316</td>
<td>&#x003E;97%(HPLC)</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetate</td>
<td>Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China</td>
<td>81014818</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China</td>
<td>10000418</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>A118881</td>
<td>High resolution</td>
</tr>
<tr>
<td>Ascorbic acid</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>A103533</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>D103272</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylene glycol</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>E103319</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>N129096</td>
<td>&ge;98.0%(HPLC)</td>
</tr>
<tr>
<td>N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide</td>
<td>ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China</td>
<td>CF259748</td>
<td>&ge;98.0%(HPLC)</td>
</tr>
<tr>
<td>Ninhydrin</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>N105629</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS buffer</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>P196986</td>
<td>pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>BIOGOT Co., Ltd, China</td>
<td>pDNA-EGFP</td>
<td>pDNA-EGFP</td>
</tr>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>BIOGOT Co., Ltd, China</td>
<td>Pdna</td>
<td>pDNA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium carbonate decahydrate</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>S112589</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>Trimethylamine</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>T103285</td>
<td>AR</td>
</tr>
</tbody>
</table>

methionine functionalized biocompatible block copolymers for targeted plasmid dna delivery

Omkeerbare toevoeging-fragmentatie ketting overdracht (RAFT) polymerisatie integreert de voordelen van radicale polymerisatie en levende polymerisatie. Dit werk presenteert de voorbereiding van methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren via RAFT polymerisatie. Ten eerste, n, n-bis(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b-N-(3-AMINOPROPYL) methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) werd gesynthetiseerd via RAFT polymerisatie met 4, 4 '-AZOBIS (4-cyanovalerische zuur) (acva) als een initiërende agent en 4-cyanopentanoïnezuur dithiobenzoaat (CTP) als de keten transfer agent. Vervolgens, n, n-bis(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b-N-(3-guanidinopropyl) methacrylamide (methionine geënt bnhema-b-gpma, mbg) werd bereid door het wijzigen van Amine groepen in APMA met methionine en guanidine Groepen. Drie soorten blok polymeren, mBG1, mBG2 en mBG3, werden gesynthetiseerd ter vergelijking. Een ninhydrine-reactie werd gebruikt om het APMA-gehalte te kwantificeren; mBG1, mBG2 en mBG3 hadden respectievelijk 21%, 37% en 52% van de APMA. De resultaten van de gelpermeatiechromatografie (GPC) toonden aan dat BA-copolymeren molecuulgewichten bezitten van 16.200 (BA1), 20900 (BA2) en 27200 (BA3) g/mol. Het plasmide DNA (pDNA) complexvormende vermogen van het verkregen blokcopolymeer gendragers werd ook onderzocht. De charge ratio's (N/P) waren 8, 16 en 4 toen pDNA volledig werd aangevuld met respectievelijk mBG1, mBG2, mBG3. Toen de N/P ratio van mBG/pDNA polyplexen hoger was dan 1, was de Zeta-potentiaal van mBG positief. Bij een N/P-verhouding tussen 16 en 32 bedroeg de gemiddelde deeltjesgrootte van mBG/pDNA-polyplexen tussen 100-200 nm. Over het algemeen illustreert dit werk een eenvoudig en handig protocol voor de copolymeer Carrier synthese van Block.

BNHEMA werd gevoed volgens de objectieve graad van polymerisatie zoals weergegeven in tabel 1; de synthese procedure van mBG wordt weergegeven in Figuur 1. Ten eerste werd BNHEMA homopolymer bereid via de omkeerbare additie-fragmentatie ketting Transfer (RAFT) methode in het water-dioxaan systeem, met behulp van 4-cyanopentanozuur dithiobenzoaat als keten transfer agent. Ten tweede werd PBNHEMA gebruikt als keten transfer agent om BNHEMA-b-APMA Block Polymer voor te...

Watch this Scientific Journal Video about Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery at JoVE.com

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Dit werk presenteert de voorbereiding van methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren (mBG) via de omkeerbare addition-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) methode. De plasmide DNA-complexering van het verkregen mBG en hun transfectie efficiëntie werden ook onderzocht. De RAFT methode is zeer gunstig voor polymerisatie monomeren met speciale functionele groepen.

Methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren voor gerichte plasmide DNA-levering

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Kationische polymeer drug dragers hebben de voordelen van een goede stabiliteit, lage immunogeniciteit, en facile voorbereiding en modificatie. Hier bieden we een snelle en eenvoudige methode voor de synthese. Omkeerbare toevoeging-fragmentatie ketting overdracht polymerisatie methode is een methode die van toepassing is op de opbrengst blok polymeren met gecontroleerde moleculair gewicht en structuur en het dragen van functionele groepen.Deze geneesmiddelendragers kunnen tegelijkertijd verschillende geneesmiddelen dragen om de samenwerkingsbehandeling van kanker, ontsteking en andere ziekten te bereiken. IFT polymerisatie is een klassieke methode, en dit protocol geeft een voorbeeld van de toepassing ervan in gentherapie. De sleutel tot het succes voor de synthese van dit polymeer is om de reactietemperatuur nauwkeurig te regelen.Het is meer aan te raden om een oliebad te gebruiken dan een waterbad. Om deze procedure te beginnen, verkrijg je een ronde-bodemkolf met een rubberen stop en een magnetische roerder die als polymerisatiefles moet worden gebruikt. Los 1,87 gram bishydroxy HEMA op in één milliliter gedestilleerd water in de polymerisatiefles.Los in een bekerglas van vijf milliliter 0,03 gram CTP en 0,02 gram ACVA op in 0,5 milliliter van 1, 4-dioxaan. Voeg dit mengsel toe aan de polymerisatiefles. Gebruik vervolgens een condensaatval om de oplossing in de polymerisatiefles te bevriezen.Bevestig de fles aan de ijzersteun, en gebruik een leiding struikelde met een naald te stofzuigen en stikstof te injecteren in de reactie mengsel. Sluit vervolgens de polymerisatiefles af en ontdooi de oplossing 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze vriespomp-dooi cyclus drie keer.Plaats de fles hierna in een oliebad op 70 graden Celsius en laat de oplossing 24 uur lang reageren onder de stikstofatmosfeer. De volgende dag, chill de polymerisatie fles op nul graden Celsius en open de rubberstop om de polymerisatiereactie te beëindigen. Vervolgens precool aceton in een koelkast bij negatieve 20 graden Celsius gedurende twee uur, en meng het met de reactie oplossing in de polymerisatie fles bij een verhouding van 50 tot een.Centrifugeren dit mengsel op 8, 200 keer g gedurende 10 minuten om de aceton te verwijderen en het neerslag te verzamelen. Om de gesynthetiseerde poly bis-hydroxy HEMA te zuiveren, los je het verzamelde neerslag op in twee milliliter zuiver water. Meng het vervolgens met 100 milliliter voorgekoelde aceton met een verhouding van 1 tot 50.Centrifugeren de oplossing op 8, 200 keer g gedurende 10 minuten om het neerslag te verzamelen. Herhaal dit zuiveringsproces van het oplossen, mengen en centrifugeren van het neerslag drie keer. Los eerst 0,96 gram APMA en 0,93 gram gezuiverde poly bis-hydroxy HEMA op in vijf milliliter gedestilleerd water in een bekerglas van 10 milliliter.Los 0,01 gram ACVA op in 0,5 milliliter van 1, 4-dioxaan en voeg dit toe aan de APMA- en polybixy HEMA-oplossing. Breng dit mengsel over op een polymerisatiefles en ventileer een uur lang met droge stikstof. Zet vervolgens de polymerisatiefles in een oliebad op 70 graden Celsius en laat het 24 uur onder de stikstofatmosfeer reageren.De volgende dag, chill de polymerisatie fles op nul graden Celsius en open de rubberstop om de polymerisatie proces oplossing te beëindigen. Om te beginnen, zaad MCF-7 cellen in de putten van een zes-put plaat bij een dichtheid van 20,000 cellen per put. Kweek de cellen in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 12 uur.Vervang hierna het kweekmedium door het verse kweekmedium met kationisch polymeer en pDNA polyplex polyplexen met verschillende verhouding tussen stikstof en fosfor. Kweek de cellen zes uur en vervang het medium vervolgens door twee milliliter vers RPMI 1640-medium. Blijf 48 uur door.Dan, het verzamelen van de cellen, en gebruik een stroom cytometer om de groene fluorescentie te detecteren. In deze studie worden methionine-gefunctionaliseerde biocompatibele blokcopolymeren bereid via de omkeerbare toevoegingsfragmentatieketenoverdrachtsmethode, en wordt het plasmide DNA-complexingvermogen van de verkregen mBG en hun transfectie-efficiëntie onderzocht. De gemiddelde deeltjesgrootte en zetapotentieel van mBG/pDNA polyplexen zijn respectievelijk 124 nanometer en plus 15,7 millivolt bij een N-to-P-verhouding van 16.Elektroforetische retardatie onthult dat pDNA met een N-to-P verhouding van nul kan bewegen zonder terughoudendheid in de agarose gel en wordt waargenomen als een streep in de gel imager. Wanneer pDNA is complex met mBG, is de beweging van pDNA vertraagd en vervolgens wordt de helderheid van de band verminderd. Dit toont aan dat mBG de pDNA volledig kan complexen wanneer de N naar P hoger is dan vier.De cytotoxiciteit van de mBG/pDNA polyplexen wordt vervolgens gemeten met behulp van de standaard MTT-test Deze resultaten tonen aan dat mBG/pDNA-polyplexen cytotoxiciteit hebben dan PEI/pDNA-polyplexen bij de N-to-P-verhoudingen van vier, acht, 16 en 32. Zoals ook te zien is, neemt de cytotoxiciteit van de mBG/pDNA polyplexen toe met een verhoogde N-to-P-verhouding. Deze verhoogde cytotoxiciteit is het gevolg van de positief geladen GPMA-component.De N-to-P-verhouding die wordt gebruikt in het pDNA-transfectie-experiment wordt geselecteerd op basis van de cytotoxiciteitsresultaten. De transfectiecapaciteiten van mBG1, mBG2 en mBG3 worden vergeleken door de GFP-fluorescentieintensiteit te meten, en de resultaten toonden aan dat mBG3 de optimale gendrager is. Het is belangrijk om lucht uit de slibronde kolf te laten uitputten en de reactietemperatuur te behouden.De verkregen polymeer drug dragers kunnen worden toegepast op de co-levering van chemotherapie drugs en gen drugs om synergetisch te behandelen resistente kanker. Het moleculaire mechanisme van combinatie van genmedicijnen en chemotherapeutische geneesmiddelen kan verder worden onderzocht voor de behandeling van resistente tumoren. Aceton wordt beoordeeld als laag giftig voor de acute toxiciteit.Sleutels, inademing of contact met ogen of huid moeten worden vermeden. Vermijd het risico van broei tijdens de verwarmingsprocedure.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Intramolecular Dehydrogenative Diels-Alder Reactions for the Synthesis of Functionalized Naphthalenes/Solvatochromic Dyes

Microgolf-geassisteerde Intramoleculaire dehydrogenerende Diels-Alder reacties voor de synthese van gefunctionaliseerde naftalenen / Solvatochromic Kleurstoffen

Functionalized naphthalenes have applications in a variety of research fields ranging from the synthesis of natural or biologically active molecules to ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Synthese en karakterisering van gefunctionaliseerde metaal-organische roosters

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Preparation and Characterization of SDF-1ÃƒÅ½Ã‚Â±-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

Functionalisering van Enkelwandige koolstof nanobuisjes met Thermo-omkeerbare Block copolymeren en karakterisering door Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

Self-assembling Morphologies Obtained from Helical Polycarbodiimide Copolymers and Their Triazole Derivatives

Zelf monteren van morfologieën Verkregen uit rechte polycarbodiimide copolymeren en hun triazoolderivaten

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

Synthese van een Thiol bouwsteen voor de kristallisatie van een halfgeleidende Gyroidal metaal-zwavel-kader

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Voorbereiding van Poly(pentafluorophenyl acrylate) matiemaatschappij SiO2 parels eiwitreiniging

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Synthesis of Monodisperse Cylindrical Nanoparticles via Crystallization-driven Self-assembly of Biodegradable Block Copolymers

Synthese van monodispers cilindrische nanodeeltjes via kristallisatie-gedreven zelf-assemblage van biologisch afbreekbaar blok copolymeren

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock ...

Efficient Synthesis of All-Carbon Quaternary Centers via the Conjugate Addition of Functionalized Monoorganozinc Bromides

Efficiënte synthese van all-Carbon quaternaire Centers via de geconjugeerde toevoeging van functionele Monoorganozinc bromiden

The conjugate addition of organometallic reagents to &#945;,&#946;-unsaturated carbonyls represents an important method to generate C&#8211;C bonds in the ...