Name: methionine functionalized biocompatible block copolymers for targeted plasmid dna delivery
Uploaded: 2019-08-06T12:30:00
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Diese Forschung wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program of China (Nr. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation of China (Nos. 81801827, 81872365), Basic Research Program of Jiangsu Province (Natural Science Foundation, No. BK20181086) und Jiangsu Cancer Hospital Scientific Research Fund (Nr. ZK201605).

1. Synthese von BNHEMA-Polymer (PBNHEMA)
<ol><li>1,87 g N, N-Bis(2-Hydroxyethyl)Methacrylamid (BNHEMA) in 1 ml destilliertem Wasser in einer Polymerisationsflasche auflösen. HINWEIS: Die Polymerisationsflasche ist ein rund-Boden-Kolben mit einem Gummistopfen und einem Magnetrührer.</li>
	<li>0,03 g 4-Cyanopentanosäure-Dithiobenzoat (CTP) und 0,02 g 4,4'-Azobis (4-Cyanovalericacid) (ACVA) in 0,5 ml 1,4-Dioxan in einem 5 ml Becher auflösen. Fügen Sie dann die CTP- und ACVA-Lösung der Polymerisa...

<ol>
	<li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Cell+Therapy+in+2018:+A+Look+Ahead.">Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead.</a> Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine-based+combination+anticancer+therapy+between+nucleic+acids+and+small-molecular+drugs.">Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+of+multidrug+resistance+breast+cancer+by+co-delivery+of+P-gp+siRNA+and+doxorubicin+via+folic+acid-modified+core-shell+nanomicelles.">Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles.</a> Colloids &amp; Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).</li><li>Quader, S., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial-Enabled+Cancer+Therapy.">Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy.</a> Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+methionine-functionalized+biocompatible+block+copolymers+for+targeted+siRNA+delivery+and+subsequent+reversal+effect+on+adriamycin+resistance+in+human+breast+cancer+cell+line+MCF-7/ADR.">Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR.</a> Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).</li><li>Szwarc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=‘Living’+Polymers.">‘Living’ Polymers.</a> Nature. 178, 168-169 (1956).</li><li>Szwarc, M., Rembaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerization+of+methyl+methacrylate+initiated+by+an+electron+transfer+to+the+monomer.">Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer.</a> Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).</li><li>Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+supramolecular+polymerization.">Living supramolecular polymerization.</a> Science. 349, 241 (2015).</li><li>Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+preparation+of+poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay+nanocomposites+via+living+cationic+ring-opening+polymerization.">In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization.</a> European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).</li><li>Wu, W., Wang, W., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Star+polymers:+Advances+in+biomedical+applications.">Star polymers: Advances in biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).</li><li>Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Mediated+Living+Radical+Polymerization+(Atom+Transfer+Radical+Polymerization+and+Copper(0)+Mediated+Polymerization):+From+Fundamentals+to+Bioapplications.">Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications.</a> Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).</li><li>Keddie, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+the+synthesis+of+block+copolymers+using+reversible-addition+fragmentation+chain+transfer+(RAFT)+polymerization.">A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization.</a> Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinylated+3-gluconamidopropyl+methacrylamide-s-3-aminopropyl+methacrylamide+copolymer+as+siRNA+carriers+for+inhibiting+human+telomerase+reverse+transcriptase+expression.">Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression.</a> Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).</li><li>Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Guanidinated+N-3-Aminopropyl+Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl+Methacrylamide+Co-polymers+as+Gene+Delivery+Carrier.">Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).</li><li>Friedman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Ninhydrin+Reaction+for+Analysis+of+Amino+Acids,+Peptides,+and+Proteins+to+Agricultural+and+Biomedical+Sciences.">Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).</li><li>Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Cyclic+Polymers+and+Characterization+of+Their+Diffusive+Motion+in+the+Melt+State+at+the+Single+Molecule+Level.">Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).</li><li>Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Characterization+of+Individual+and+Multi-drug+Loaded+Physically+Entrapped+Polymeric+Micelles.">Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles.</a> Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).</li></ol>

Diese Studie führte eine Reihe von BNHEMA-b-APMA Block polymeren Genträgern ein. Diese Blockpolymere wurden über das reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransferverfahren (RAFT) synthetisiert. Das hydrophile Segment BNHEMA wurde eingeführt, um die Löslichkeit zu verbessern. Methionin- und Guanidingruppen wurden modifiziert, um die Zielfähigkeit und Transfektionseffizienz zu verbessern5. Der APMA-Kettengehalt erhöhte sich und die Guanidinylierung im mBG-Copolymer reduzierte die Partik...

In den letzten Jahren hat sich die Gentherapie für die therapeutische Abgabe von Nukleinsäuren als Medikamente zur Behandlung aller Arten vonKrankheiten1 herausgebildet. Die Entwicklung von Genmedikamenten einschließlich Plasmid-DNA (pDNA) und kleiner störender RNA (siRNA) beruht auf der Stabilität und Effizienz des Arzneimittelabgabesystems (DDS)2. Unter allen DDS haben kationische Polymerträger die Vorteile einer guten Stabilität, geringen Immunogenität und einfachen Vorbereitung und Modifikation, die kationischen Polymerträgern breite Anwendungsperspektiven geben3,4. Für praktische Anwendungen in der Biomedizin müssen Forscher einen kationischen Polymerträger mit hoher Effizienz, geringer Toxizität und guter Targeting-Fähigkeit finden5. Unter allen Polymerträgern sind Blockcopolymere eines der am häufigsten verwendeten Arzneimittelabgabesysteme. Blockcopolymere werden intensiv auf ihre Selbstmontageeigenschaften und Fähigkeiten zur Bildung von Mizellen, Mikrosphären und Nanopartikeln in der Wirkstoffabgabeuntersucht 5. Blockcopolymere können über lebende Polymerisation oder Klickchemiemethoden synthetisiert werden.
1956 sprachen Szwarc et al. das Thema der lebenden Polymerisation an und definierten es als Reaktion ohne kettenbrechende Reaktionen6,7. Seitdem wurden mehrere Techniken entwickelt, um Polymere mit dieser Methode zu synthetisieren; Daher wird die lebende Polymerisation als Meilenstein der Polymerwissenschaft8angesehen. Lebende Polymerisation kann in lebende anionische Polymerisation, lebende kationische Polymerisation und reversible Deaktivierung sradikalpolymerisation (RDRP)9klassifiziert werden. Lebende anionische/kationische Polymerisationen haben aufgrund ihrer strengen Reaktionsbedingungen einen begrenzten Anwendungsbereich10. Die kontrollierte/lebende Radikalpolymerisation (CRP) hat milde Reaktionsbedingungen, eine bequeme Disposition und eine gute Ausbeute und war damit in den letzten Jahren ein schwerpunktweise11. In CRP werden aktive Ausbreitungsketten reversibel zu ruhenden passiviert, um die Konzentration freier Radikale zu reduzieren und die bimolekulare Reaktion von sich ausbreitenden Kettenradikalen zu vermeiden. Die Additionspolymerisation kann nur fortgesetzt werden, wenn die inaktiven ruhenden Vermehrungsketten reversibel zu Kettenradikalen animiert werden. Als eine der vielversprechendsten Formen der lebenden Radikalpolymerisation ist die reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer-Polymerisation (RAFT) ein Verfahren, das zur Ausbeute von Blockpolymeren mit kontrolliertem Molekulargewicht und Struktur, schmalem Molekulargewicht Verteilung und das Tragen von Funktionsgruppen12. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen RAFT-Polymerisation ist die Wirkung von Kettentransfermitteln, meist Dithioeten, die eine sehr hohe Kettentransferkonstante besitzen.
In diesem Papier wurde ein RAFT-Polymerisationsverfahren entwickelt, um BNHEMA-b-APMA-Blockpolymer zu zubereiten, wobei 4,4'-Azobis(4-Cyanovalersäure) (ACVA) als Initiierungsmittel und 4-Cyanopentanosäure-Dithiobenzoat (CTP) als Kettentransfermittel verwendet werden. Die RAFT-Polymerisation wurde zweimal verwendet, um BNHEMA in die kationischen Polymerträger einzuführen. Anschließend wurden die Amingruppen in der APMA-Kette mit Methionin und dem Guanidaylierungsreagenz 1-Amidinopyzolhydrochlorid modifiziert. Durch die Verwendung der positiven Ladungen des Guanidalylierungsreagenzes und der Methacrylamid-Polymerskelettstruktur wurde die zelluläre Aufnahmeeffizienz der erhaltenen Blockpolymerträger verbessert.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>1-hydroxybenzotriazole</td>
<td>Macklin Biochemical Co., Ltd,China</td>
<td>H810970</td>
<td>&ge;97.0%</td>
</tr>
<tr>
<td>1,4-dioxane</td>
<td>Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China</td>
<td>10008918</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>1-amidinopyrazole Hydrochloride</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>A107935</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>E106172</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>4,4&#x2019;-azobis(4-cyanovaleric acid)</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>A106307</td>
<td>Analytical reagent (AR)</td>
</tr>
<tr>
<td>4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>C132316</td>
<td>&#x003E;97%(HPLC)</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetate</td>
<td>Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China</td>
<td>81014818</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China</td>
<td>10000418</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>A118881</td>
<td>High resolution</td>
</tr>
<tr>
<td>Ascorbic acid</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>A103533</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>D103272</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylene glycol</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>E103319</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>N129096</td>
<td>&ge;98.0%(HPLC)</td>
</tr>
<tr>
<td>N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide</td>
<td>ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China</td>
<td>CF259748</td>
<td>&ge;98.0%(HPLC)</td>
</tr>
<tr>
<td>Ninhydrin</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>N105629</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS buffer</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>P196986</td>
<td>pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>BIOGOT Co., Ltd, China</td>
<td>pDNA-EGFP</td>
<td>pDNA-EGFP</td>
</tr>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>BIOGOT Co., Ltd, China</td>
<td>Pdna</td>
<td>pDNA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium carbonate decahydrate</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>S112589</td>
<td>AR</td>
</tr>
<tr>
<td>Trimethylamine</td>
<td>Aladdin Co., Ltd., China</td>
<td>T103285</td>
<td>AR</td>
</tr>
</tbody>
</table>

methionine functionalized biocompatible block copolymers for targeted plasmid dna delivery

Die reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragung (RAFT)-Polymerisation integriert die Vorteile der Radikalpolymerisation und der lebenden Polymerisation. Diese Arbeit stellt die Herstellung von Methionin funktionalisierten biokompatiblen Blockcopolymeren über RAFT-Polymerisation vor. Erstens wurde N,N-Bis(2-Hydroxyethyl)methacrylamid-b-N-(3-aminopropyl)methacrylamid (BNHEMA-b-APMA, BA) mittels RAFT-Polymerisation mit 4,4'-Azobis(4-Cyanovalersäure) (ACVA) als Initiierungsmittel und 4-Cyanopentanosäure Dithiobenzoat (CTP) als Kettentransfermittel. Anschließend wurde N,N-bis(2-Hydroxyethyl)Methacrylamid-b-(3-guanidinopropyl)methacrylamid (Methionin transplantiert BNHEMA-b-GPMA, mBG) durch Modifizieren von Amingruppen in APMA mit Methionin und Guanidin hergestellt. Gruppen. Drei Arten von Blockpolymeren, mBG1, mBG2 und mBG3, wurden zum Vergleich synthetisiert. Eine Ninhydrin-Reaktion wurde verwendet, um den APMA-Gehalt zu quantifizieren; mBG1, mBG2 und mBG3 hatten 21 %, 37 % bzw. 52 % aPMA. Die Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie (GPC) zeigten, dass BA-Copolymere Molekulargewichte von 16.200 (BA1), 20.900(BA2) und 27.200(BA3) g/mol besitzen. Die Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit der erhaltenen Blockcopolymer-Genträger wurde ebenfalls untersucht. Die Ladungsverhältnisse (N/P) waren 8, 16 und 4, wenn pDNA vollständig mit mBG1, mBG2, mBG3 komplexiert wurde. Wenn das N/P-Verhältnis von mBG/pDNA-Polyplexen höher als 1 war, war das Zeta-Potenzial von mBG positiv. Bei einem N/P-Verhältnis zwischen 16 und 32 lag die durchschnittliche Partikelgröße von mBG/pDNA-Polyplexen zwischen 100-200 nm. Insgesamt veranschaulicht diese Arbeit ein einfaches und bequemes Protokoll für die Blockcopolymer-Trägersynthese.

BNHEMA wurde nach dem in Tabelle 1angegebenen objektiven Polymerisationsgrad gefüttert; das Syntheseverfahren von mBG ist in Abbildung 1dargestellt. Zunächst wurde BNHEMA Homopolymer über das reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer-Verfahren (RAFT) im Wasser-Dioxan-System unter Verwendung von 4-Cyanopentanosäure-Dithiobenzoat als Kettentransfermittel hergestellt. Zweitens wurde PBNHEMA als Kettentransfermittel zur Herstellung von BNHEMA-b-APMA-Blockp...

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Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Diese Arbeit stellt die Herstellung von Methionin funktionalisierten biokompatiblen Blockcopolymeren (mBG) über das reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer-Verfahren (RAFT) vor. Die Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit des erhaltenen mBG und ihre Transfektionseffizienz wurden ebenfalls untersucht. Die RAFT-Methode ist sehr vorteilhaft für die Polymerisation von Monomeren, die spezielle funktionelle Gruppen enthalten.

Methionin funktionalisierte biokompatible Blockcopolymere für gezielte Plasmid-DNA-Lieferung

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Kationische Polymer-Wirkstoffträger haben die Vorteile einer guten Stabilität, geringen Immunogenität und einer einfachen Vorbereitung und Modifikation. Hier bieten wir eine schnelle und einfache Methode für seine Synthese. Reversible Addition-Fragmentierungs-Verkettungspolymerisationsmethode ist ein Verfahren, das zur Ausbeute von Blockpolymeren mit kontrolliertem Molekulargewicht und Struktur und tragender funktioneller Gruppen geeignet ist.Diese Arzneimittelträger können gleichzeitig verschiedene Medikamente tragen, um die Zusammenarbeit Behandlung von Krebs, Entzündungen und anderen Krankheiten zu erreichen. Die IFT-Polymerisation ist eine klassische Methode, und dieses Protokoll gibt ein Beispiel für seine Anwendung in der Gentherapie. Der Schlüssel zum Erfolg für die Synthese dieses Polymers ist die präzise Steuerung der Reaktionstemperatur.Es ist ratsamer, ein Ölbad als ein Wasserbad zu verwenden. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie einen rund-Boden-Kolben mit einem Gummistopfen und einem Magnetischen Rührer, der als Polymerisationsflasche verwendet werden soll. 1,87 Gramm Bis-Hydroxy-HEMA in einem Milliliter destilliertem Wasser in der Polymerisationsflasche auflösen.In einem Fünf-Milliliter-Becher 0,03 Gramm CTP und 0,02 Gramm ACVA in 0,5 Milliliter 1, 4-Dioxan auflösen. Fügen Sie diese Mischung in die Polymerisationsflasche. Verwenden Sie dann eine Kondensatfalle, um die Lösung in der Polymerisationsflasche einzufrieren.Befestigen Sie die Flasche an der Eisenstütze, und verwenden Sie einen mit einer Nadel ausgelösten Schlauch, um Stickstoff in das Reaktionsgemisch zu saugen und zu injizieren. Versiegeln Sie dann die Polymerisationsflasche und tauen Sie die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Wiederholen Sie diesen Freeze-Pump-Tau-Zyklus dreimal.Danach die Flasche bei 70 Grad Celsius in ein Ölbad geben und die Lösung 24 Stunden unter der Stickstoffatmosphäre reagieren lassen. Am nächsten Tag die Polymerisationsflasche bei null Grad Celsius abkühlen und den Gummistopfen öffnen, um die Polymerisationsreaktion zu beenden. Als nächstes präcooles Aceton im Kühlschrank bei minus 20 Grad Celsius für zwei Stunden und mischen Sie es mit der Reaktionslösung in der Polymerisationsflasche im Verhältnis 50 zu eins.Zentrifugieren Sie diese Mischung bei 8, 200 mal g für 10 Minuten, um das Aceton zu entfernen und den Niederschlag zu sammeln. Um das synthetisierte Poly-Bis-Hydroxy-HEMA zu reinigen, lösen Sie den gesammelten Niederschlag in zwei Milliliter reinem Wasser auf. Dann mischen Sie es mit 100 Milliliter vorgekühltem Aceton im Verhältnis eins zu 50.Zentrifugieren Sie die Lösung bei 8, 200 mal g für 10 Minuten, um den Niederschlag zu sammeln. Wiederholen Sie diesen Reinigungsprozess des Lösens, Mischens und Zentrifugierens des Niederschlags dreimal. Lösen Sie zunächst 0,96 Gramm APMA und 0,93 Gramm des gereinigten Poly-Bis-Hydroxy-HEMA in fünf Milliliter destilliertem Wasser in einem 10-Milliliter-Becher.0,01 Gramm ACVA in 0,5 Millilitern 1, 4-Dioxan auflösen und der APMA- und Poly-Bis-Hydroxy-HEMA-Lösung hinzufügen. Diese Mischung in eine Polymerisationsflasche geben und eine Stunde lang mit trockenem Stickstoff belüften. Dann die Polymerisationsflasche bei 70 Grad Celsius in ein Ölbad geben und 24 Stunden unter der Stickstoffatmosphäre reagieren lassen.Am nächsten Tag die Polymerisationsflasche bei null Grad Celsius abkühlen und den Gummistopfen öffnen, um die Polymerisationslösung zu beenden. Zunächst säen SIE MCF-7-Zellen in die Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Brunnen. Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 12 Stunden.Ersetzen Sie danach das Kulturmedium durch das frische Kulturmedium, das kationisches Polymer und pDNA-Polyplex-Polyplexe mit unterschiedlichem Verhältnis von Stickstoff-Phosphor-Verhältnissen enthält. Kultur die Zellen für sechs Stunden, und dann ersetzen Sie das Medium mit zwei Milliliter frische RPMI 1640 Medium. Fahren Sie mit der Kultivierung für 48 Stunden fort.Sammeln Sie dann die Zellen, und verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um die grüne Fluoreszenz zu erkennen. In dieser Studie werden Methionin-funktionalisierte biokompatible Blockcopolymere über die reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungsmethode hergestellt und die Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit des erhaltenen mBG und ihre Transfektionseffizienz untersucht. Die durchschnittliche Partikelgröße und das Zeta-Potenzial von mBG/pDNA-Polyplexen betragen 124 Nanometer bzw. plus 15,7 Millivolt bei einem N-Zu-P-Verhältnis von 16.Die elektrophoretische Retardierung zeigt, dass sich pDNA mit einem N-zu-P-Verhältnis von Null im Agarose-Gel ohne Einschränkungen bewegen kann und als Streifen im Gelbildr beobachtet wird. Wenn pDNA mit mBG komplexiert wird, wird die Bewegung von pDNA verzögert, und in der Folge wird die Helligkeit des Bandes reduziert. Dies zeigt, dass mBG die pDNA vollständig komplexisieren kann, wenn n bis P höher als vier ist.Die Zytotoxizität der mBG/pDNA-Polyplexe wird dann mit dem Standard-MTT-Assay gemessen Diese Ergebnisse zeigen, dass mBG/pDNA-Polyplexe eine Zytotoxizität haben als PEI/pDNA-Polyplexe bei den N-zu-P-Verhältnissen von vier, acht, 16 und 32. Wie auch zu sehen ist, steigt die Zytotoxizität der mBG/pDNA-Polyplexe mit einem erhöhten N-zu-P-Verhältnis. Diese erhöhte Zytotoxizität ist ein Ergebnis der positiv geladenen GPMA-Komponente.Das im pDNA-Transfektionsexperiment verwendete N-zu-P-Verhältnis wird entsprechend den Zytotoxizitätsergebnissen ausgewählt. Die Transfektionsfähigkeiten von mBG1, mBG2 und mBG3 werden durch Messung der GFP-Fluoreszenzintensität verglichen, und die Ergebnisse zeigten, dass mBG3 der optimale Genträger ist. Es ist wichtig, Luft aus dem Schlick-Rundbodenkolben abzuschöpfen und die Reaktionstemperatur aufrechtzuerhalten.Die erhaltenen Polymer-Wirkstoffträger können auf die gleichzeitige Abgabe von Chemotherapie-Medikamenten und Genmedikamenten angewendet werden, um medikamentenresistenten Krebs synergistisch zu behandeln. Der molekulare Mechanismus der Kombination von Genmedikamenten und Chemotherapeutika kann für die Behandlung von medikamentenresistenten Tumoren weiter erforscht werden. Aceton wird wegen seiner akuten Toxizität als niedrig toxisch eingestuft.Schlüssel, Einatmen oder Kontakt mit Augen oder Haut sollten vermieden werden. Vermeiden Sie das Risiko von Verbrühungen während des Heizvorgangs.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Forschung

Chemie

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