Name: automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00
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这项工作由克拉福德基金会（TM和PN）、瑞典政府研究基金（PN、TM）、瑞典研究理事会（PN）和格罗辛斯基基金会（TM，PN）资助。

隆德大学道德委员会根据《赫尔辛基宣言》（2013/728）批准从健康志愿者中采集静脉血。所有志愿者都提供了书面知情同意。
1. 使用密度-梯度离心分离外周血中性粒细胞的分离
<ol><li>在含有肝素的管中收集人类静脉血，使管达到室温。 注意：至少需要健康献血者16 mL的血液才能产生足够大的细胞颗粒。</li>
	<li>将血液与盐水中的 2% dextran（0.9% NaCl）混合，在室温下在无菌 5...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis:+how+vital+is+it?.">NETosis: how vital is it?.</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa.">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+determination+of+NET+(neutrophil+extracellular+traps)+coverage+in+fluorescent+microscopy+images.">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li><li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETQUANT:+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps.">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer.">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li><li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).</li></ol>

NET的形成是一个相对较新的除了不同的中性粒细胞武器4，并已出现了明显激增的兴趣，研究NET在广泛的研究领域5，7，14，15。使用免疫荧光显微镜和随后基于图像的定量采集图像是一种广泛使用的量化 NET 的方法。这种方法的优点是能够检测在单细胞水平上形成NET的细胞，因此可以?...

嗜中性粒细胞是对抗各种微生物病原体的先天宿主防御反应的关键中介。它们通过释放含有多种抗菌蛋白2的颗粒、产生活性氧（ROS）和次氯酸盐1以及通过方噬菌体3来执行其抗菌功能。此外，布林克曼等人。4将嗜中性粒细胞外陷阱 （NETs） 描述为一种新型机制，通过这种机制，嗜中性粒细胞可以捕获和消除入侵的病原体。自从十多年前发现4，NETS就与各种传染性的5、6和非传染性7病症有关。NET形成是一个活跃的过程，导致染色质DNA的挤出涂有颗粒衍生抗菌蛋白8。与NET形成相关的细胞和核形态的一些关键变化包括核形态的丧失、染色质变性、将颗粒蛋白从细胞质调动到细胞核以及增加核和细胞直径8、9。
网络状的NET，可能显示为比细胞稍大的漫射结构或比单个嗜中性粒细胞大好几倍的结构，被认为是NETosis5，10的指标。使用荧光显微镜，通过检测DNA，如4'，6-二酰胺-2-phenylindole（DAPI），并通过免疫荧光染色对NET结合的蛋白质，如中性粒细胞介酶，可以检测NET。在图11中，DNA和NET结合蛋白的重叠染色区域的量化决定了NET下的总面积。
有许多图像分析选项可用于执行基于荧光图像的NETs11、12的定量。但是，这些软件选项在用户不友好和/或完全自动化方面存在限制。在本文中，我们演示了NETQUANT13的操作，这是一个免费的应用程序，可以执行无偏的全自动免疫荧光显微镜基于NET定量。该应用程序具有用户友好的图形界面 （GUI），可以执行单单元分析。该软件通过检测DNA-NET结合标记区域的形态变化、染色质分离相关细胞核变形和DNA：NET结合蛋白比的增加来量化图像中的NETosis。综合起来，多个 NET 定义标准允许以无偏的方式跨多个数据集进行严格的 NET 量化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10626491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Coverslips 10mm</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>CS10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>631-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary anti-human elastase</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>DAKO rabbit 1373, contract immunization</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11072, A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Zyla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x, 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macOS Sierra 10.12</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant

嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）是由DNA和颗粒衍生抗菌蛋白组成的类似网络的抗菌结构。免疫荧光显微镜和基于图像的定量方法仍然是定量中性粒细胞细胞外陷阱形成的重要工具。然而，目前可用于量化NET的基于荧光的方法存在关键局限性。基于图像的 NET 量化的手动方法通常是主观的，对于用户（尤其是没有经验的用户）来说，容易出错和繁琐。此外，目前可用的量化软件选项要么是半自动的，要么需要在操作前进行培训。在这里，我们演示了基于免疫荧光的自动图像定量方法的实现，以评估NET形成称为NETQUANT。该软件易于使用，具有用户友好的图形用户界面（GUI）。它考虑了与生物学相关的参数，如表面积和DNA：NET标记蛋白比的增加，以及核变形，以定义NET的形成。此外，此工具是作为一个免费的应用程序构建的，并允许单细胞分辨率量化和分析。

5 x 105嗜中性粒细胞/mL 被播种在放置在 12 孔板上的盖玻片上，用 20 nM PMA 刺激或离开未刺激 150 分钟。然后，使用原发兔抗人类中性粒细胞乳酸酶抗体、二级山羊抗兔氟荧光抗体和DAPI（一种带有荧光标签的染色DNA的染料）对样本进行染色（详情见材料表）。然后，使用荧光显微镜和20X（NA = 0.75）目标获取至少5个图像。通过按照<a href="https://nordlab.med.lu.s...

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Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

在这里，我们提出了一个协议，用于生成中性粒细胞外陷阱（NETs）和操作NETQUANT，这是一种用于定量免疫荧光图像中的NET的全自动软件选项。

使用 NETQUANT 对中性粒细胞外陷阱的自动基于图像的定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

在这里，我们介绍 NETQUANT，一种全自动的方法，用于量化 NETS 和免疫荧光图像。这将有助于研究人员根据多个用户和条件生成的数据进行可比较的图像分析。该技术的优点是易用性、单细胞数据分析、评估NET形成的多种标准以及对多个图像的公正分析。安装并打开分析软件。可以在 Zenodo GitHub 存档或诺顿费尔特实验室网站上找到最新版本。在"设置"选项卡中，通过单击源菜单中的 get 路径选项选择源文件夹进行分析。选择要分析的图像序列的文件夹。同样，单击目标菜单中的 get 路径选项，然后选择目标文件夹以在图像分析后保存数据。接下来，当使用单独的通道图像时，命名通道文件夹，使DNA通道与核DNA染色相对应，NET通道描绘图像中的中性粒细胞弹性酶染色。此外，将包含控件图像文件的文件夹名称为控件。接下来，单击加载图像信息按钮，将图像元数据加载到软件中。然后在通道顺序子菜单中，选择图像中包含的正确通道顺序。这有助于防止意外不匹配。现在单击准备数据按钮从原始数据获取主图像属性并转换图像。然后，转换后的图像将显示在示例类型子菜单中。单击示例类型菜单，从子菜单中选择一个图像，然后单击显示图像数据，以显示分别拆分为 DNA 和中性粒细胞外陷阱或 NET 通道的图像。要将细胞分段到各自的通道中，请选择分段方法选项卡，并在方法子菜单中为 DNA 和 NET 通道选择一个方法。默认的分段方法设置为自适应，是推荐的设置。软件中还有其他选项，包括全局边缘和 chanverse。还包括了一个分水岭选项，以帮助区分放置紧密的细胞或NET。此外，在分段选项卡中，单击分段控件示例选项。然后从示例类型子菜单中选择 PMA，然后单击批处理选项，开始分割数据集中包含的所有图像。接下来，选择示例类型菜单中的图像，然后单击显示图像数据按钮，以可视化和验证分割后生成的 DNA 和 NET 蒙版的二进制图像蒙版。现在，在分析选项卡中，单击确定阈值按钮以分析控制样本。然后，在右侧将样本类型更改为 PMA，然后单击 get 单元格属性按钮以完成对受刺激样本的分析。接下来，从示例类型子菜单中选择一个图像，然后单击显示图像数据按钮以显示图像中的叠加以及单元格数和 NET 成形单元格的数量。首先从示例类型子菜单中选择示例。可以从样本类型子菜单中选择单个图像进行分析，也可以通过选择批处理选项分析整个图像批次。选择后，单击分析 NETs 按钮以完成分析。手动调整 NET 条件，为给定样本生成最佳结果。将已识别的 性 性 内与原始图像进行比较，以评估识别质量。完成此步骤后，可以在数据集中的所有图像中应用 NET 条件。对 NET 条件所做的任何更改也同时应用于所有控制示例。检查单元格数据子菜单中的数据摘要，其中显示图像数、每个图像的单元格数和每个图像的 NET 百分比。输入输出选项卡以选择和查看结果输出。通过选择输出的形式并单击输出结果按钮，探索并比较从控制和 PMA 处理样本分析中生成的各种数据输出。接下来，启动结果数据表 CSV 文件以探索单单元数据，然后单击结果 PDF 文件以可视化样本中的 NET 区域分布和 DNA 与 NET 比率。红线表示图形中的阈值。最后，单击结果双变量分布文件以确定 DNA 的 NET 区域与形状。在这里，在10分钟内分析了15张控制性嗜中性粒细胞图像和15张PMA刺激的嗜中性粒细胞图像。使用本文中描述的自动定量方法计算细胞总数，确定具有中性粒细胞外陷阱的细胞百分比。这些结果表明，PMA刺激的嗜中性粒细胞具有较大的面积，核变形的增加，并且与对照样品的DNA与NET比更高。当组合成 3D 图形时，PMA 刺激的样本往往比对照样本显示紧固分组的区域。在尝试该过程时，必须记住，尽管工作流是使用多个捐赠者测试的，但建议用户根据单个数据集适当地决定软件参数。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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方法来研究中性粒细胞脂质的改变和中性粒细胞胞外陷阱随后形成

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使用免疫荧光显微镜鉴定帕芬-嵌入式猫动脉血栓中中性粒细胞外陷阱

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

使用改良的夹心 ELISA 定量来自中性粒细胞胞外陷阱的髓过氧化物酶 DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶 DNA 复合物

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

人和小鼠组织中性粒细胞胞外陷阱的免疫荧光成像

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...