Name: automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00
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Les travaux ont été financés par la Fondation Crafoord (TM et PN), la subvention du gouvernement suédois pour la recherche (PN, TM), le Conseil suédois de la recherche (PN) et la Fondation Groschinsky (TM, PN).

Le comité d'éthique de l'Université de Lund a approuvé la collecte de sang veineux auprès de volontaires en bonne santé conformément à la Déclaration d'Helsinki (2013/728). Tous les bénévoles ont donné leur consentement éclairé écrit.
1. Isolement des neutrophiles périphériques de sang utilisant la centrifugation de densité-gradient
<ol><li>Recueillir le sang veineux humain dans des tubes contenant de l'héparine et permettre aux tubes d'atteindre la température ambiante.<...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis:+how+vital+is+it?.">NETosis: how vital is it?.</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa.">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+determination+of+NET+(neutrophil+extracellular+traps)+coverage+in+fluorescent+microscopy+images.">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li><li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETQUANT:+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps.">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer.">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li><li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).</li></ol>

La formation de NET est un ajout relativement récent à l'armamentarium neutrophile diversifié4 et il y a eu un regain d'intérêt notable pour étudier l'implication des NET dans un large éventail de domaines de recherche5,7,14,15. L'acquisition d'images à l'aide de la microscopie immunofluorescence et de la quantification à base d'images subséquente est une méth...

Les neutrophiles sont des médiateurs cruciaux des réponses innées de défense d'hôte contre une grande variété d'agents pathogènes microbiens1. Ils exécutent leurs fonctions antimicrobiennes en libérant leurs granules contenant un large éventail de protéines antimicrobiennes2, produisant des espèces réactives d'oxygène (ROS) et de l'hypochlorite1, et par phagocytose3. En outre, Brinkmann et coll. 4 ont décrit les pièges extracellulaires de neutrophile (NETs) comme mécanisme nouveau par lequel les neutrophiles piègent et éliminent les pathogènes envahissants. Depuis leur découverte il y a un peu plus d'une décennie4, les TN ont été impliqués dans une grande variété de morbidités infectieusesde 5,6 et non infectieuses7. La formation de NET est un processus actif et entraîne l'extrusion de l'ADN de chromatine enduit de protéines antimicrobiennes dérivées du granule8. Certains des changements clés dans la morphologie cellulaire et nucléaire associée à la formation net comprennent la perte de morphologie nucléaire, la décondensation de chromatine, la mobilisation des protéines granules du cytoplasme au noyau et une augmentation du diamètre nucléaire et cellulaire8,9.
Les NET sain, qui peuvent apparaître comme des structures diffuses légèrement plus grandes que la cellule ou comme des structures plusieurs fois plus grandes qu'un seul neutrophile sont considérées comme des indicateurs de NETosis5,10. À l'aide de la microscopie à fluorescence, les TNE peuvent être détectés en sondant l'ADN à l'aide d'une sonde fluorescente comme l'élastase de 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et par la coloration immunofluorescence contre les protéines liées au NET comme l'élastase de neutrophile. La quantification des zones de coloration qui se chevauchent pour l'ADN et les protéines liées à l'EI détermine la superficie totale sous les EE dans une image11.
Un certain nombre d'options d'analyse d'image sont disponibles pour effectuer la quantification basée sur l'image de fluorescence des NETs11,12. Mais ces options logicielles présentent des limites en n'étant pas convivialet et/ou entièrement automatisé. Dans cet article, nous démontrons le fonctionnement de NETQUANT13, une application librement disponible qui peut effectuer une microscopie immunofluorescence entièrement automatisée impartiale sur l'image de la quantification NET. L'application dispose d'une interface graphique conviviale (GUI) et peut effectuer une analyse monocellulaire. Le logiciel quantifie neTosis dans une image en détectant les changements morphologiques dans le domaine du marqueur lié à l'ADN-NET, la décondensation de chromatine a associé la déformation du noyau et l'augmentation du rapport protéine LIÉ à l'ADN: NET. Pris ensemble, les multiples critères de définition NET permettent une quantification NET rigoureuse sur plusieurs ensembles de données de manière impartiale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10626491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Coverslips 10mm</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>CS10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>631-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary anti-human elastase</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>DAKO rabbit 1373, contract immunization</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11072, A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Zyla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x, 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macOS Sierra 10.12</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures antimicrobiennes web-like se composant de l'ADN et des protéines antimicrobiennes dérivées de granule. La microscopie d'immunofluorescence et les méthodes de quantification basées sur l'image demeurent des outils importants pour quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles. Cependant, il y a des limites clés aux méthodes basées sur l'immunofluorescence qui sont actuellement disponibles pour quantifier les ENI. Les méthodes manuelles de quantification NET basée sur l'image sont souvent subjectives, sujettes à l'erreur et fastidieuses pour les utilisateurs, en particulier les utilisateurs non expérimentés. En outre, les options logicielles actuellement disponibles pour la quantification sont soit semi-automatiques ou nécessitent une formation avant l'opération. Ici, nous démontrons la mise en œuvre d'une méthode automatisée de quantification d'image basée sur l'immunofluorescence pour évaluer la formation net appelée NETQUANT. Le logiciel est facile à utiliser et dispose d'une interface utilisateur graphique conviviale (GUI). Il tient compte de paramètres biologiquement pertinents tels qu'une augmentation de la surface et du rapport protéine marqueur DNA:NET, et la déformation nucléaire pour définir la formation de l'EI. En outre, cet outil est conçu comme une application librement disponible, et permet de quantifier et d'analyser la résolution d'une seule cellule.

5 x 105 neutrophiles/mL ont été ensepépins sur des feuilles de couverture placées dans une plaque de 12 puits et stimulées avec 20 nM PMA ou laissées non stimulées pendant 150 min. Les échantillons ont ensuite été tachés à l'aide d'anticorps primaires d'élastase de neutrophiles de lapin, d'anticorps conjugués secondaires de fluorophore anti-lapin de chèvre et d'anticorps conjugués d'API - un colorant fluorescent étiqueté qui tache l'ADN (voir le tablea...

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Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Nous présentons ici NETQUANT, une approche entièrement automatisée pour quantifier les images de NETS et d’immunofluorescence. Cela aidera les chercheurs à faire une analyse d’image comparable à partir des données générées par plusieurs utilisateurs et conditions. Les avantages de cette technique sont la facilité d’utilisation, l’analyse des données unicell cellules, de multiples critères pour évaluer la formation de NET, et une analyse impartiale de plusieurs images.Installez et ouvrez le logiciel d’analyse. Une version à jour se trouve sur les archives Zenodo GitHub ou sur le site Web de Nordonfelt Lab. Dans l’onglet configuration, choisissez un dossier source pour analyse en cliquant sur l’option obtenir le chemin dans le menu source.Sélectionnez le dossier contenant les séquences d’images à analyser. Encore une fois, cliquez sur l’option obtenir le chemin dans le menu cible, et sélectionnez le dossier cible pour enregistrer les données suivant l’analyse d’image. Ensuite, lors de l’utilisation d’images de canaux distincts, nommez les dossiers du canal de sorte que le canal d’ADN corresponde à la tache d’ADN nucléaire, et le canal NET représente la tache d’élasstase neutrophile dans les images.En outre, nommez le dossier contenant les fichiers d’image de contrôle comme contrôle. Ensuite, cliquez sur le bouton d’information sur l’image de charge et chargez les métadonnées d’image dans le logiciel. Ensuite, dans le sous-menu de commande de canal, sélectionnez l’ordre de canal correct contenu dans les images.Cela permet de prévenir les inadéquations accidentelles. Cliquez maintenant sur le bouton préparer les données pour acquérir des propriétés d’image primaires à partir des données brutes et convertir les images. Les images converties apparaîtront ensuite dans le sous-menu des types d’échantillons.Cliquez sur le menu de type échantillon, sélectionnez une image dans le sous-menu et cliquez sur les données d’image d’affichage pour afficher les images divisées en piège extracellulaire de l’ADN et du neutrophile, ou canal NET, respectivement. Pour segmenter les cellules dans leurs canaux respectifs, sélectionnez l’onglet méthode de segmentation et sélectionnez une méthode dans le sous-menu de la méthode pour les canaux ADN et NET. La méthode par défaut de segmentation est définie comme adaptative et est le paramètre recommandé.D’autres options sont disponibles dans le logiciel, y compris l’avantage global et chanverse. Une option de bassin versant a également été incluse pour aider à distinguer entre les cellules étroitement placées ou les NETs. Toujours dans l’onglet segmentation, cliquez sur l’option échantillons de contrôle du segment.Sélectionnez ensuite PMA à partir du sous-menu type d’échantillon et cliquez sur l’option lot pour commencer la segmentation de toutes les images incluses dans l’ensemble de données. Ensuite, sélectionnez les images dans le menu de type échantillon et cliquez sur le bouton de données d’image d’affichage pour visualiser et valider les masques d’image binaires pour les masques ADN et NET générés après segmentation. Maintenant, dans l’onglet analyse, cliquez sur le bouton seuil de déterminer pour analyser les échantillons de contrôle.Ensuite, sur le côté droit, changer le type d’échantillon en PMA et cliquez sur le bouton obtenir des propriétés cellulaires pour compléter l’analyse des échantillons stimulés. Ensuite, sélectionnez une image dans le sous-menu de type échantillon et cliquez sur le bouton de données d’image d’affichage pour afficher la superposition et le nombre de cellules et de cellules formant net dans l’image. Commencez par sélectionner l’échantillon dans le sous-menu de type échantillon.Les images individuelles peuvent être sélectionnées à partir du sous-menu de type échantillon pour analyse ou l’ensemble du lot d’images peut être analysé en sélectionnant l’option de lot. Une fois sélectionné, cliquez sur le bouton NETs analyser pour compléter l’analyse. Ajustez manuellement les critères NET pour obtenir des résultats optimaux pour un échantillon donné.Comparez les NET identifiés avec les images originales pour évaluer la qualité de l’identification. Une fois cette étape terminée, les critères NET peuvent être appliqués sur toutes les images de l’ensemble de données. Toutes les modifications apportées aux critères NET sont également appliquées simultanément à tous les échantillons de contrôle.Inspectez le résumé des données dans le sous-menu des données cellulaires, où le nombre d’images, le nombre de cellules par image et le pourcentage de NET par image sont affichés. Entrez l’onglet sortie pour sélectionner et afficher les sorties des résultats. Explorez et comparez les différentes sorties de données générées par l’analyse des échantillons traités par le contrôle et la PMA en sélectionnant la forme de la sortie et en cliquant sur le bouton résultats de sortie.Ensuite, lancez le fichier CSV du tableau des résultats pour explorer les données unicell cellules et cliquez sur les résultats des fichiers PDF pour visualiser la distribution de la zone NET et le rapport ADN/NET dans les échantillons. La ligne rouge indique la valeur seuil dans les graphiques. Enfin, cliquez sur le fichier de distribution bivarié des résultats pour déterminer la zone NET par rapport à la forme de l’ADN.Ici, 15 images de neutrophiles de contrôle et 15 images de neutrophiles stimulés par la PMA ont été analysées en moins de dix minutes. Le nombre total de cellules a été compté et le pourcentage de cellules avec des pièges extracellulaires neutrophiles a été déterminé en utilisant la méthode automatisée de quantification décrite dans cet article. Ces résultats montrent que les neutrophiles stimulés par la PMA ont une plus grande superficie, une augmentation de la déformation nucléaire et un rapport ADN/NET plus élevé que les échantillons de contrôle.Lorsqu’ils sont combinés dans un graphique 3D, les échantillons stimulés par la PMA ont tendance à montrer des zones de regroupements de resserrement que les échantillons de contrôle. Tout en essayant la procédure, il est important de se rappeler que bien que le flux de travail ait été testé à l’aide de plusieurs donateurs, il est recommandé que l’utilisateur décide des paramètres logiciels de manière appropriée en fonction de l’ensemble de données individuel.

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Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

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Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

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