Name: automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT at JoVE.com

इस काम को क्रैफोर्ड फाउंडेशन (टीएम और पीएन), स्वीडिश गवर्नमेंट रिसर्च ग्रांट (पीएन, टीएम), स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (पीएन) और ग्रोश्िंस्की फाउंडेशन (टीएम, पीएन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

लुंड विश्वविद्यालय की आचार समिति ने हेलसिंकी (2013/728) की घोषणा के अनुसार स्वस्थ स्वयंसेवकों से शिरारक्त के संग्रह को मंजूरी दी । सभी स्वयंसेवकों ने अपनी लिखित सूचित सहमति प्रदान की ।
1. घनत्व-ढाल ...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis:+how+vital+is+it?.">NETosis: how vital is it?.</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa.">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+determination+of+NET+(neutrophil+extracellular+traps)+coverage+in+fluorescent+microscopy+images.">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li><li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETQUANT:+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps.">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer.">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li><li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).</li></ol>

नेट गठन विविध न्यूट्रोफिल आयुध4 के लिए अपेक्षाकृत हाल ही में जोड़ दिया गया है और अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में NETs के निहितार्थ का अध्ययन करने के लिए ब्याज की एक उल्लेखनीय वृद्ध...

न्यूट्रोफिल विभिन्न प्रकार के माइक्रोबियल रोगजनकों1के खिलाफ सहज मेजबान रक्षा प्रतिक्रियाओं के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं। वे अपने कणिकाओं को रिहा करके अपने रोगाणुरोधी कार्यों को निष्पादित करते हैं जिनमें रोगाणुरोधी प्रोटीन2की एक विस्तृत श्रृंखला होती है, जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और हाइपोक्लोराइट1का उत्पादन करती है, और फागोसाइटोसिस3के माध्यम से। इसके अलावा ब्रिंकमैन एट अल । 4 ने न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (NETs) को एक उपन्यास तंत्र बताया जिसके द्वारा न्यूट्रोफिल जाल और हमलावर रोगजनकों को खत्म करते हैं। उनकी खोज के बाद से एक दशक पहले4से थोड़ा अधिक, NETs संक्रामक5,6 और गैर संक्रामक7 रुग्णियों की एक विस्तृत विविधता में फंसाया गया है । नेट गठन एक सक्रिय प्रक्रिया है और इसके परिणामस्वरूप क्रोनिलिन डीएनए का निष्कासन कण-व्युत्पन्न रोगाणुरोधी प्रोटीन8से लेपित होता है । नेट गठन से जुड़े सेलुलर और परमाणु आकृति विज्ञान में कुछ महत्वपूर्ण परिवर्तनों में परमाणु आकृति विज्ञान का नुकसान, क्रोमेटिन डिकंजेशन, साइटोप्लाज्म से नाभिक तक कणिका प्रोटीन जुटाना और परमाणु और सेलुलर व्यास8,9में वृद्धि शामिल है ।
वेब की तरह NETs, जो कोशिका से थोड़ा बड़ा संरचनाओं के रूप में प्रकट हो सकता है या संरचनाओं के रूप में कई बार एक ही न्यूट्रोफिल से बड़ा NETosis5,10के संकेतक के रूप में माना जाता है । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, 4', 6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) जैसे फ्लोरोसेंट जांच के साथ डीएनए की जांच करके और न्यूट्रोफिल इलास्टेज़ जैसे नेट-बाउंड प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करके एनटीका का पता लगाया जा सकता है। डीएनए और नेट-बाउंड प्रोटीन के लिए धुंधला करने वाले क्षेत्रों का परिमाणीकरण एक छवि11में NETs के तहत कुल क्षेत्र निर्धारित करता है ।
एनईटीएस11,12के फ्लोरेसेंस इमेज बेस्ड क्वांटिफिकेशन करने के लिए इमेज एनालिसिस के कई विकल्प उपलब्ध हैं । लेकिन इन सॉफ्टवेयर विकल्प उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं किया जा रहा है और/या पूरी तरह से स्वचालित में सीमाएं मौजूद हैं । इस लेख में, हम NETQUANT13के संचालन को प्रदर्शित करते हैं, जो एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऐप है जो निष्पक्ष पूरी तरह से स्वचालित प्रतिकार माइक्रोस्कोपी छवि आधारित नेट क्वांटिफिकेशन कर सकता है। ऐप में यूजर फ्रेंडली ग्राफिकल इंटरफेस (जीयूआई) है और यह सिंगल-सेल एनालिसिस कर सकता है । सॉफ्टवेयर डीएनए-नेट-बाउंड मार्कर के क्षेत्र में रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाकर एक छवि में नेटोसिस की मात्रा निर्धारित करता है, न्यूक्लियस के क्रोमेटिन विवर्तन से जुड़ा हुआ है और डीएनए: नेट-बाउंड प्रोटीन अनुपात में वृद्धि होती है । एक साथ लिया, कई नेट परिभाषा मापदंड एक निष्पक्ष फैशन में कई डेटा सेट भर में कड़े नेट मात्रा करण के लिए अनुमति देता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10626491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Coverslips 10mm</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>CS10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>631-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary anti-human elastase</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>DAKO rabbit 1373, contract immunization</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11072, A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Zyla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x, 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macOS Sierra 10.12</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस) वेब जैसी एंटीमाइक्रोबियल संरचनाएं हैं जिनमें डीएनए और दाने दार ी से प्राप्त रोगाणुरोधी प्रोटीन शामिल हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और छवि आधारित क्वांटिफिकेशन विधियां न्यूट्रोफिल बाह्य जाल गठन को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण बनी हुई हैं। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित तरीकों की प्रमुख सीमाएं हैं जो वर्तमान में एनईटीएस की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपलब्ध हैं। छवि आधारित नेट क्वांटिफिकेशन के मैनुअल तरीके अक्सर व्यक्तिपरक होते हैं, उपयोगकर्ताओं, विशेष रूप से गैर-अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए त्रुटि और थकाऊ होने की संभावना होती है। इसके अलावा, वर्तमान में क्वांटिफिकेशन के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर विकल्प या तो अर्ध-स्वचालित हैं या ऑपरेशन से पहले प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यहां, हम नेटक्वांट नामक नेट गठन का मूल्यांकन करने के लिए एक स्वचालित प्रतिकार आधारित छवि क्वांटिफिकेशन विधि के कार्यान्वयन को प्रदर्शित करते हैं। सॉफ्टवेयर का उपयोग करना आसान है और इसमें उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) है। यह जैविक रूप से प्रासंगिक मापदंडों जैसे सतह क्षेत्र में वृद्धि और डीएनए: नेट मार्कर प्रोटीन अनुपात, और नेट गठन को परिभाषित करने के लिए परमाणु विरूपण पर विचार करता है । इसके अलावा, यह उपकरण एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऐप के रूप में बनाया गया है, और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन क्वांटिफिकेशन और विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

5 x १०५ न्यूट्रोफिल/mL को 12-अच्छी प्लेट में रखे गए कवरस्लिप पर वरीयता दी गई थी और या तो 20 एनएम पीएमए के साथ उत्तेजित किया गया था या १५० मिन के लिए अउत्तेजित छोड़ दिया गया था । इसके बाद नमूनों क?...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT at JoVE.com

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

यहां, हम न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस) और ऑपरेटिंग नेटक्वांट पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों में एनईटीएस के परिमाणीकरण के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित सॉफ्टवेयर विकल्प है।

नेटक्वांट का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप का स्वचालित छवि-आधारित क्वांटिफिकेशन

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

यहां हम नेटक्विंट पेश करते हैं, जो जाल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित दृष्टिकोण है। यह शोधकर्ताओं को कई उपयोगकर्ताओं और शर्तों द्वारा उत्पन्न डेटा से तुलनीय छवि विश्लेषण करने में मदद करेगा । इस तकनीक के फायदे उपयोग में आसानी, एकल-कोशिका डेटा विश्लेषण, नेट गठन का मूल्यांकन करने के लिए कई मानदंड, और कई छवियों का निष्पक्ष विश्लेषण है।विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्थापित करें और खोलें। एक अप-टू-डेट संस्करण ज़ेनडो गिटहब आर्काइव या नॉर्डोनफेल्ट लैब वेबसाइट पर पाया जा सकता है। सेटअप टैब में, स्रोत मेनू में प्राप्त पथ विकल्प पर क्लिक करके विश्लेषण के लिए एक स्रोत फ़ोल्डर चुनें।विश्लेषण किए जाने वाले इमेज सीक्वेंस वाले फोल्डर का चयन करें। फिर, लक्ष्य मेनू में पाथ ऑप्शन पर क्लिक करें, और इमेज एनालिसिस के बाद डेटा को सेव करने के लिए टारगेट फोल्डर चुनें । इसके बाद, अलग चैनल छवियों का उपयोग करते समय, चैनल फ़ोल्डर्स का नाम दें ताकि डीएनए चैनल परमाणु डीएनए दाग से मेल खाता है, और नेट चैनल छवियों में न्यूट्रोफिल इलास्टेज दाग को दर्शाता है।इसके अलावा, नियंत्रण छवि फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर को नियंत्रण के रूप में नाम दें। इसके बाद, लोड इमेज इंफॉर्मेशन बटन पर क्लिक करें और इमेज मेटाडेटा को सॉफ्टवेयर में लोड करें। फिर चैनल ऑर्डर सब-मेनू में, छवियों में निहित सही चैनल ऑर्डर का चयन करें।यह आकस्मिक बेमेल को रोकने में मदद करता है। अब कच्चे डेटा से प्राथमिक छवि गुण प्राप्त करने और छवियों को परिवर्तित करने के लिए तैयार डेटा बटन पर क्लिक करें। परिवर्तित छवियां फिर नमूना प्रकार उप-मेनू में दिखाई देंगी।नमूना प्रकार मेनू पर क्लिक करें, उप-मेनू से एक छवि का चयन करें और क्रमशः डीएनए और न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप, या नेट चैनल में विभाजित छवियों को प्रदर्शित करने के लिए डिस्प्ले इमेज डेटा पर क्लिक करें। कोशिकाओं को अपने संबंधित चैनलों में विभाजित करने के लिए, विभाजन विधि टैब का चयन करें, और डीएनए और नेट चैनलों दोनों के लिए विधि उप-मेनू में एक विधि का चयन करें। विभाजन की डिफ़ॉल्ट विधि अनुकूली के लिए सेट है और अनुशंसित सेटिंग है।ग्लोबल एज और चांवित सहित अन्य विकल्प सॉफ्टवेयर में उपलब्ध हैं। बारीकी से रखी गई कोशिकाओं या एनईटी के बीच अंतर करने में मदद करने के लिए एक वाटरशेड विकल्प भी शामिल किया गया है । इसके अलावा सेगमेंटेशन टैब में सेगमेंट कंट्रोल सैंपल्स ऑप्शन पर क्लिक करें।फिर नमूना प्रकार उप-मेनू से पीएमए का चयन करें और डेटा सेट में शामिल सभी छवियों के विभाजन को शुरू करने के लिए बैच विकल्प पर क्लिक करें। इसके बाद, नमूना प्रकार मेनू में छवियों का चयन करें और पोस्ट-सेगमेंटेशन उत्पन्न डीएनए और नेट मास्क दोनों के लिए बाइनरी इमेज मास्क की कल्पना और सत्यापन करने के लिए डिस्प्ले इमेज डेटा बटन पर क्लिक करें। अब, विश्लेषण टैब में, नियंत्रण नमूनों का विश्लेषण करने के लिए निर्धारित सीमा बटन पर क्लिक करें।फिर, दाहिने हाथ की ओर, नमूना प्रकार को पीएमए में बदलें और उत्तेजित नमूनों के विश्लेषण को पूरा करने के लिए गेट सेल गुण बटन पर क्लिक करें। इसके बाद, नमूना प्रकार उप-मेनू से एक छवि का चयन करें और छवि में ओवरले और कोशिकाओं और नेट बनाने वाली कोशिकाओं की संख्या प्रदर्शित करने के लिए डिस्प्ले इमेज डेटा बटन पर क्लिक करें। नमूना प्रकार उप मेनू से नमूना का चयन करके शुरू करो।विश्लेषण के लिए नमूना प्रकार उप-मेनू से अलग-अलग छवियों का चयन किया जा सकता है या बैच विकल्प का चयन करके छवियों के पूरे बैच का विश्लेषण किया जा सकता है। एक बार चयनित होने के बाद, विश्लेषण पूरा करने के लिए विश्लेषण NETs बटन पर क्लिक करें। किसी दिए गए नमूने के लिए इष्टतम परिणाम देने के लिए नेट मापदंड को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।पहचान की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए मूल छवियों के साथ पहचाने गए NETs की तुलना करें। एक बार जब यह चरण पूरा हो जाता है, तो डेटासेट में सभी छवियों में नेट मानदंड लागू किए जा सकते हैं। नेट मानदंडों में किए गए किसी भी परिवर्तन को भी एक साथ सभी नियंत्रण नमूनों पर लागू किया जाता है।सेल डेटा उप-मेनू में डेटा सारांश का निरीक्षण करें, जहां छवियों की संख्या, प्रति छवि सेल गिनती, और प्रति छवि NETs का प्रतिशत प्रदर्शित किया जाता है। रिजल्ट आउटपुट को चुनने और देखने के लिए आउटपुट टैब डालें। आउटपुट के रूप का चयन करके और आउटपुट परिणाम बटन पर क्लिक करके नियंत्रण और पीएमए-उपचारित नमूनों के विश्लेषण से उत्पन्न विभिन्न डेटा आउटपुट का अन्वेषण और तुलना करें।इसके बाद, एकल-सेल डेटा का पता लगाने के लिए परिणाम डेटा टेबल सीएसवी फाइल लॉन्च करें और नमूनों में नेट क्षेत्र वितरण और डीएनए से नेट अनुपात की कल्पना करने के लिए पीडीएफ फाइलों के परिणामों पर क्लिक करें। लाल रेखा रेखांकन में सीमा मूल्य को इंगित करती है। अंत में, डीएनए के आकार बनाम नेट क्षेत्र निर्धारित करने के लिए परिणाम द्विविध वितरण फ़ाइल पर क्लिक करें ।यहां, नियंत्रण न्यूट्रोफिल की 15 छवियों और पीएमए द्वारा उत्तेजित न्यूट्रोफिल की 15 छवियों का दस मिनट के तहत विश्लेषण किया गया । कोशिकाओं की कुल संख्या गिना गया और न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप के साथ कोशिकाओं का प्रतिशत इस लेख में वर्णित स्वचालित मात्राकरण विधि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि पीएमए-उत्तेजित न्यूट्रोफिल में एक बड़ा क्षेत्र है, परमाणु विरूपण में वृद्धि हुई है, और नियंत्रण नमूनों की तुलना में शुद्ध अनुपात के लिए एक उच्च डीएनए है ।जब एक 3 डी ग्राफ में संयुक्त, PMA उत्तेजित नमूनों को नियंत्रण नमूनों की तुलना में समूहों को कसने के क्षेत्रों को दिखाने के लिए करते हैं । प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि हालांकि कई दानदाताओं का उपयोग करके कार्यप्रवाह का परीक्षण किया गया था, यह सिफारिश की जाती है कि उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत डेटा सेट के आधार पर सॉफ्टवेयर मापदंडों पर उचित रूप से निर्णय लेना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

न्युट्रोफिल कोशिकी जाल: कैसे उत्पन्न करने के लिए और उन्हें कल्पना

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

सरलीकृत मानव न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) अलगाव और हैंडलिंग

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

विधियों का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रोफिल में लिपिड बदलाव और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल के बाद के गठन

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

कुत्ते न्युट्रोफिल कोशिकी जाल रिलीज की मात्रा का ठहराव के लिए एक सरल प्रतिदीप्ति परख

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

visualizing Macrophage Extracellular जाल का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड फेलिन धमनी थ्रोम्बी में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप की पहचान

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप का रूपात्मक और रचनात्मक विश्लेषण

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

एक संशोधित सैंडविच एलिसा का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप से मायलोपेरोक्सीडेज-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस-डीएनए कॉम्प्लेक्स की मात्रा निर्धारित करना

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

मानव और माउस ऊतकों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...