Name: automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00
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Il lavoro è stato finanziato dalla Crafoord Foundation (TM e PN), dalla borsa svedese per la ricerca del governo (PN, TM), dal consiglio svedese per la ricerca (PN) e dalla Fondazione Groschinsky (TM, PN).

Il comitato etico dell'Università di Lund ha approvato la raccolta di sangue venoso da volontari sani in conformità con la Dichiarazione di Helsinki (2013/728). Tutti i volontari hanno fornito il loro consenso informato scritto.
1. Isolamento dei neutrofili del sangue periferico usando la centrifugazione densità-gradiente
<ol><li>Raccogliere il sangue venoso umano in tubi contenenti eparina e consentire ai tubi di raggiungere la temperatura ambiente. Nota: È necessario un minimo di 16...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Sorensen, O. 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K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa.">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+determination+of+NET+(neutrophil+extracellular+traps)+coverage+in+fluorescent+microscopy+images.">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li><li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETQUANT:+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps.">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer.">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li><li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).</li></ol>

La formazione della rete è un'aggiunta relativamente recente all'armamentario neutrofilo variegato4 e c'è stato un notevole aumento di interesse per studiare l'implicazione di NET in una vasta gamma di aree di ricerca5,7,14,15. L'acquisizione di immagini mediante la microscopia immunofluorescenza e la successiva quantificazione basata sulle immagini è un metodo ampiam...

Neutrophils sono mediatori cruciali delle risposte innate alla difesa dell'ospite contro un'ampia varietà di patogeni microbici1. Essi eseguono le loro funzioni antimicrobiche rilasciando i loro granuli contenenti una vasta gamma di proteine antimicrobiche2, producendo specie reattive dell'ossigeno (ROS) e ipocloriterite1, e attraverso la fagocitosi3. Inoltre, Brinkmann et al. 4 ha descritto le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) come un nuovo meccanismo con il quale i neutrofili intrappolano ed eliminano gli agenti patogeni invasori. Dalla loro scoperta poco più di un decennio fa4, NETs sono stati implicati in una vasta gamma di infettive5,6 e non-infettivo7 morbilità. La formazione della rete è un processo attivo e si traduce nell'estrusione del DNA della cromatina rivestito con proteine antimicrobiche derivate dai granuli8. Alcuni dei cambiamenti chiave nella morfologia cellulare e nucleare associata alla formazione di NET includono la perdita di morfologia nucleare, decondensazione della cromatina, mobilitazione delle proteine granule dal citoplasma al nucleo e un aumento del diametro nucleare e cellulare8,9.
I NET simili al web, che possono apparire come strutture diffuse leggermente più grandi della cellula o come strutture diverse volte più grandi di un singolo neutrofilo sono considerati indicatori di NETosis5,10. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, i NET possono essere rilevati sondando il DNA con una sonda fluorescente come la fenomenazione 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e la colorazione dell'immunofluorescenza contro le proteine del limite di rete come l'elastasi neutrofila. La quantificazione delle aree sovrapposte di colorazione per il DNA e le proteine del NET determina l'area totale sotto i NET nell'immagine11.
Sono disponibili diverse opzioni di analisi delle immagini per eseguire la quantificazione basata sull'immagine a fluorescenza dei NET11,12. Ma queste opzioni software presentano limitazioni nel non essere user-friendly e/ o completamente automatizzato. In questo articolo viene illustrato il funzionamento di NETQUANT13, un'app liberamente disponibile in grado di eseguire una microscopia a microscopia completamente automatizzata non imparziale. L'applicazione ha un'interfaccia grafica intuitiva (GUI) e può eseguire l'analisi a cella singola. Il software quantifica NETosis in un'immagine rilevando i cambiamenti morfologici nell'area del marcatore legato al DNA-NET, la decondensazione della cromatina associata alla deformazione del nucleo e l'aumento del rapporto proteico DNA:NET. Nel loro insieme, i criteri di definizione NET multipli consentono una rigorosa quantificazione NET in diversi set di dati in modo imparziale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10626491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Coverslips 10mm</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>CS10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>631-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary anti-human elastase</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>DAKO rabbit 1373, contract immunization</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11072, A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Zyla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x, 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macOS Sierra 10.12</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant

Le trappole extracellulari Neutrophil (NET) sono strutture antimicrobiche simili a reti formiche di proteine antimicrobiche derivate dal DNA e dal granulo. La microscopia dell'immunofluorescenza e i metodi di quantificazione basati sull'immagine rimangono strumenti importanti per quantificare la formazione di trape extracellulari di neutrofili. Tuttavia, esistono limitazioni chiave ai metodi basati sull'immunofluorescenza che sono attualmente disponibili per quantificare i NET. I metodi manuali di quantificazione NET basata su immagini sono spesso soggettivi, soggetti a errori e noiosi per gli utenti, in particolare gli utenti non esperti. Inoltre, le opzioni software attualmente disponibili per la quantificazione sono semi-automatiche o richiedono una formazione prima del funzionamento. Qui, dimostriamo l'implementazione di un metodo automatizzato di quantificazione delle immagini basato sull'immunofluorescenza per valutare la formazione della rete chiamata NETQUANT. Il software è facile da usare e ha un'interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva. Considera parametri biologicamente rilevanti come un aumento della superficie e il rapporto di proteina del marcatore DNA:NET e la deformazione nucleare per definire la formazione della rete. Inoltre, questo strumento è costruito come un'applicazione liberamente disponibile, e consente la quantificazione e l'analisi di risoluzione singola.

5 x 105 neutrofili/mL sono stati seminati su copricapi posizionati in una piastra di 12 pozze e stimolati con 20 nM di PMA o lasciati non stimolati per 150 min. I campioni sono stati poi macchiati utilizzando anticorpi contro il controcatena di controilofilo contro l'uomo del coniglio primario, anticorpi coniugati per i dettagli della tavola dei materiali anti-coniglio anti-coniglio e DAPI - un colorante fluorescente etichettato con DNA (vedi la tabella dei mat...

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Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Qui presentiamo NETQUANT, un approccio completamente automatizzato per quantificare le immagini NETS e immunofluorescenza. Ciò aiuterà i ricercatori a effettuare analisi delle immagini comparabili dai dati generati da più utenti e condizioni. I vantaggi di questa tecnica sono la facilità d'uso, l'analisi dei dati a cella singola, più criteri per valutare la formazione net e un'analisi imparziale di più immagini.Installare e aprire il software di analisi. Una versione aggiornata è disponibile sull'archivio Zenodo GitHub o sul sito Web Nordonfelt Lab. Nella scheda setup scegliere una cartella di origine per l'analisi facendo clic sull'opzione ottieni percorso nel menu di origine.Selezionare la cartella contenente le sequenze di immagini da analizzare. Anche in questo caso, fare clic sull'opzione ottieni percorso nel menu di destinazione e selezionare la cartella di destinazione per salvare i dati dopo l'analisi delle immagini. Successivamente, quando si utilizzano immagini di canale separate, denominare le cartelle del canale in modo che il canale del DNA corrisponda alla macchia di DNA nucleare e il canale NET raffigura la macchia di elastasi neutrofila nelle immagini.Assegnare inoltre un nome alla cartella contenente i file di immagine del controllo come controllo. Fare quindi clic sul pulsante carica informazioni immagine e caricare i metadati dell'immagine nel software. Quindi, nel sottochio menu dell'ordine del canale, selezionare l'ordine corretto del canale contenuto nelle immagini.Questo aiuta a prevenire disallineamenti accidentali. Ora fai clic sul pulsante prepara dati per acquisire le proprietà dell'immagine primaria dai dati non elaborati e convertire le immagini. Le immagini convertite verranno quindi visualizzate nel sotto-menu dei tipi di esempio.Fare clic sul menu del tipo di campione, selezionare un'immagine dal sottochi menu e fare clic sui dati dell'immagine visualizzata per visualizzare le immagini suddivise rispettivamente nel DNA e nella trappola extracellulare neutrofila o nel canale NET. Per segmentare le cellule nei rispettivi canali, selezionare la scheda del metodo di segmentazione e selezionare un metodo nel sottochia menu del metodo sia per il DNA che per i canali NET. Il metodo predefinito di segmentazione è impostato su adaptive ed è l'impostazione consigliata.Altre opzioni sono disponibili nel software tra cui bordo globale e chanverse. È stata inclusa anche un'opzione spartiacque per aiutare a distinguere tra cellule o NET posizionati da vicino. Anche nella scheda segmentazione, fare clic sull'opzione esempi di controllo del segmento.Quindi selezionare PMA dal sottochi menu di tipo di esempio e fare clic sull'opzione batch per iniziare la segmentazione di tutte le immagini incluse nel set di dati. Selezionare quindi le immagini nel menu del tipo di esempio e fare clic sul pulsante visualizza dati immagine per visualizzare e convalidare le maschere immagine binarie sia per le maschere DNA che NET generate dopo la segmentazione. Ora, nella scheda analisi, fare clic sul pulsante determina soglia per analizzare gli esempi di controllo.Quindi, sul lato destro, cambiare il tipo di campione in PMA e fare clic sul pulsante ottieni proprietà cella per completare l'analisi dei campioni stimolati. Selezionare quindi un'immagine dal sottochio menu del tipo di esempio e fare clic sul pulsante visualizza dati immagine per visualizzare la sovrapposizione e il numero di celle e celle di formazione NET nell'immagine. Iniziare selezionando l'esempio dal sottochilo menu del tipo di esempio.Le singole immagini possono essere selezionate dal sottochio menu del tipo di campione per l'analisi o l'intero batch di immagini può essere analizzato selezionando l'opzione batch. Una volta selezionata, fare clic sul pulsante analizza NET per completare l'analisi. Regolare manualmente i criteri NET per ottenere risultati ottimali per un determinato campione.Confronta i NET identificati con le immagini originali per valutare la qualità dell'identificazione. Una volta completato questo passaggio, i criteri NET possono essere applicati a tutte le immagini del set di dati. Qualsiasi modifica apporta ai criteri NET viene applicata contemporaneamente anche a tutti i campioni di controllo.Esaminare il riepilogo dei dati nel sottochio menu dei dati delle celle, in cui vengono visualizzati il numero di immagini, il numero di celle per immagine e la percentuale di NET per immagine. Immettere la scheda output per selezionare e visualizzare gli output dei risultati. Esplorare e confrontare i vari output di dati generati dall'analisi dei campioni trattati con controllo e PMA selezionando la forma dell'output e facendo clic sul pulsante dei risultati di output.Avviare quindi il file CSV della tabella dati dei risultati per esplorare i dati a cella singola e fare clic sui file PDF dei risultati per visualizzare la distribuzione dell'area NET e il rapporto DNA/NET nei campioni. La linea rossa indica il valore di soglia nei grafici. Infine, fare clic sul file di distribuzione bivariato dei risultati per determinare l'area NET rispetto alla forma del DNA.Qui, 15 immagini di neutrofili di controllo e 15 immagini di neutrofili stimolati dal PMA sono state analizzate in meno di dieci minuti. Il numero totale di cellule è stato conteggiato e la percentuale di cellule con trappole extracellulari neutrofile è stata determinata utilizzando il metodo di quantificazione automatizzato descritto in questo articolo. Questi risultati mostrano che i neutrofili stimolati dal PMA hanno un'area più ampia, un aumento della deformazione nucleare e un rapporto DNA/NET più elevato rispetto ai campioni di controllo.Se combinati in un grafico 3D, i campioni stimolati dal PMA tendono a mostrare aree di raggruppamenti di serraggio rispetto ai campioni di controllo. Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare che, sebbene il flusso di lavoro sia stato testato utilizzando più donatori, si consiglia all'utente di decidere i parametri software in modo appropriato in base al singolo set di dati.

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