Name: automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT at JoVE.com

この研究は、クラフォード財団(TMおよびPN)、スウェーデン政府研究助成金(PN、TM)、スウェーデン研究評議会(PN)、グロシンスキー財団(TM、PN)によって資金提供されました。

ルンド大学の倫理委員会は、ヘルシンキ宣言(2013/728)に従って、健康なボランティアからの静脈血の収集を承認しました。すべてのボランティアは、彼らの書面によるインフォームドの同意を提供しました。
1. 密度勾配遠心分離を用いた末梢血好中球の単離
<ol><li>ヘパリンを含むチューブでヒトの静脈血を収集し、チューブが室温に達することを可能にします。 注:健...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis:+how+vital+is+it?.">NETosis: how vital is it?.</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa.">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+determination+of+NET+(neutrophil+extracellular+traps)+coverage+in+fluorescent+microscopy+images.">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li><li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETQUANT:+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps.">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer.">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li><li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).</li></ol>

NET形成は、多様な好中球武装体4に比較的最近の付加であり、幅広い研究領域5、7、14、15におけるNETの影響を研究することに関心が高まっています。免疫蛍光顕微鏡を用いた画像の取得とその後の画像ベースの定量は、NETを定量するために広く使用されている方法です。このアプ...

好中球は、多種多様な微生物病原体1に対する先天的な宿主防御応答の重要なメディエーターである。彼らは、抗菌タンパク質2の広い配列を含む顆粒を放出することによって、その抗菌機能を実行し、活性酸素種(ROS)および次亜塩素酸塩1を産生し、食細胞症3を介して生じる。また、ブリンクマンら4は、好中球が侵入病原体を捕捉し排除する新しいメカニズムとして好中球細胞外トラップ(NETs)を記載した。彼らの発見は10年以上前4年に以来、NETは感染性5、6および非感染性7罹患率の多種多様に関与してきた。NET形成は活性プロセスであり、顆粒由来抗菌タンパク質8で被覆されたクロマチンDNAの押出をもたらす。NET形成に関連する細胞および核形態の主要な変化のいくつかは、核形態の喪失、クロマチン縮合、細胞質から核への顆粒タンパク質の動員および核および細胞直径の増加を含む。
ウェブ様NETは、細胞よりもわずかに大きい拡散構造として、または単一の好中球よりも数倍大きい構造として見えることがあり、NETosis5、10の指標と考えられる。蛍光顕微鏡を用いて、4',6-ジアミディノ-2-フェニルリンドール(DAPI)などの蛍光プローブでDNAを探査し、好中球エラスターゼなどのNET結合タンパク質に対する免疫蛍光染色によりNETを検出できます。DNAおよびNET結合タンパク質に対する染色の重なり領域の定量は、画像11におけるNETの下の総面積を決定する。
NETs11、12の蛍光画像ベースの定量を行うために、多くの画像解析オプションが利用可能である。しかし、これらのソフトウェアオプションは、ユーザーフレンドリーで完全に自動化されていないという制限があります。この記事では、バイアスのかからなからり完全に自動化された免疫蛍光顕微鏡顕微鏡画像ベースのNET定量を実行できる、自由に利用できるアプリ「NETQUANT13」の動作を実演します。アプリは、ユーザーフレンドリーなグラフィカルインターフェイス(GUI)を持っており、単一セル分析を実行することができます。本ソフトウェアは、DNA-NET結合マーカーの領域における形態学的変化を検出することにより、画像中のNETosisを定量し、クロマチンは核の変形に関連し、DNA:NET結合タンパク質比の増加を検出する。複数の NET 定義基準を組み合わせることで、複数のデータ セット間で厳密な NET 定量を公平に行うことができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10626491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Coverslips 10mm</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>CS10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>631-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary anti-human elastase</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>DAKO rabbit 1373, contract immunization</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11072, A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Zyla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x, 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macOS Sierra 10.12</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant

好中球細胞外トラップ(NET)は、DNAおよび顆粒由来抗菌タンパク質からなるウェブ様抗菌構造である。免疫蛍光顕微鏡および画像ベースの定量方法は、好中球細胞外トラップ形成を定量するための重要なツールを残しています。ただし、NET の定量に現在使用できる免疫蛍光ベースの方法には、主な制限があります。イメージ ベースの NET 定量化の手動方法は、多くの場合、主観的で、エラーが発生しやすく、ユーザー、特に経験の浅いユーザーにとっては面倒です。また、定量化のための現在利用可能なソフトウェアオプションは、半自動または操作前にトレーニングが必要です。ここでは、NETQUANTと呼ばれるNET形成を評価するための自動免疫蛍光ベースの画像定量法の実装を示す。ソフトウェアは使いやすく、ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を持っています。表面積やDNA:NETマーカータンパク質比の増加、核変形など生物学的に関連するパラメータを考慮してNET形成を定義します。さらに、このツールは自由に利用できるアプリとして構築され、単一セル分解能の定量化と分析を可能にします。

5 x 105好中球/mLを12ウェルプレートに入れたカバーリップに播種し、20 nM PMAまたは150分間無刺激のままにして刺激した。次いで、原発ウサギ抗ヒト好中球エラスターゼ抗体、二次ヤギ抗ウサギフルオロフォア共役抗体およびDAPIを用いて試料を染色した(詳細は材料表参照)。その後、エピ蛍光顕微鏡と20X(NA =0.75)の目的を用いて、最低5枚の画像を取得?...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT at JoVE.com

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

ここでは、好中球細胞外トラップ(NET)を生成し、NETQUANTを動作させるプロトコルを提示し、免疫蛍光画像におけるNETの定量のための全自動ソフトウェアオプションを提示する。

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

ここでは、NETSおよび免疫蛍光画像を定量化するための完全に自動化されたアプローチであるNETQUANTを紹介します。これにより、研究者は複数のユーザーや条件によって生成されたデータから同等の画像解析を行うことができます。この手法の利点は、使いやすさ、単一細胞データ分析、NET 形成を評価する複数の基準、および複数の画像の公平な分析です。解析ソフトウェアをインストールして開きます。最新バージョンは、ゼノドGitHubアーカイブ、またはノルドンフェルトラボのウェブサイトで見つけることができます。[設定] タブで、ソース メニューの [パスの取得] オプションをクリックして、分析するソース フォルダを選択します。解析するイメージ シーケンスを含むフォルダを選択します。再度、ターゲットメニューの「パスを取得」オプションをクリックし、画像分析後にデータを保存するターゲットフォルダーを選択します。次に、別々のチャンネル画像を使用する場合、DNAチャネルが核DNA染色に対応するようにチャンネルフォルダに名前を付け、NETチャンネルは画像内の好中球エラスターゼ染色を描写する。また、コントロール イメージ ファイルを含むフォルダーにコントロールの名前を付けます。次に、画像情報の読み込みボタンをクリックし、イメージメタデータをソフトウェアにロードします。次に、チャンネルオーダーサブメニューで、画像に含まれる正しいチャンネル順序を選択します。これは、偶発的な不一致を防ぐのに役立ちます。次に、[データの準備] ボタンをクリックして、生データからプライマリ画像プロパティを取得し、画像を変換します。変換後の画像は、サンプルタイプのサブメニューに表示されます。サンプルタイプメニューをクリックし、サブメニューから画像を選択し、ディスプレイ画像データをクリックして、DNAと好中球外細胞トラップ、またはNETチャンネルに分割された画像をそれぞれ表示します。細胞をそれぞれのチャンネルに分割するには、セグメンテーション方法タブを選択し、DNAとNETチャンネルの両方の方法サブメニューで方法を選択します。セグメンテーションの既定の方法はアダプティブに設定されており、推奨される設定です。その他のオプションは、グローバルエッジやチャンバースを含むソフトウェアで利用可能です。近くに配置されたセルと NET を区別するために、流域オプションも含まれています。また、セグメンテーション タブで、セグメント制御サンプル オプションをクリックします。次に、サンプル・タイプ・サブメニューから PMA を選択し、バッチ・オプションをクリックして、データ・セットに含まれるすべてのイメージのセグメンテーションを開始します。次に、サンプルタイプメニューで画像を選択し、表示画像データボタンをクリックして、セグメンテーション後に生成されたDNAマスクとNETマスクの両方のバイナリ画像マスクを視覚化して検証します。次に、解析タブで、制御サンプルを分析するしきい値の決定ボタンをクリックします。次に、右側でサンプルタイプをPMAに変更し、細胞プロパティの取得ボタンをクリックして、刺激されたサンプルの分析を完了します。次に、サンプルタイプのサブメニューから画像を選択し、画像データ表示ボタンをクリックして、画像内のオーバーレイとセル数とNETフォームセル数を表示します。まず、サンプルタイプのサブメニューからサンプルを選択します。個々の画像は、分析用のサンプルタイプのサブメニューから選択するか、バッチオプションを選択して画像のバッチ全体を分析することができます。選択したら、[NET の解析] ボタンをクリックして解析を完了します。NET 基準を手動で調整して、特定のサンプルに最適な結果を得ることができます。識別された NET と元の画像を比較して、識別の品質を評価します。この手順が完了すると、データセット内のすべての画像に NET 条件を適用できます。また、NET 基準に対する変更は、すべてのコントロール サンプルにも同時に適用されます。セル データ サブメニューで、画像の数、画像あたりのセル数、および画像ごとの NET の割合が表示されるデータの概要を調べます。出力タブを入力して、結果の出力を選択して表示します。出力の形式を選択して出力結果ボタンをクリックすることにより、制御およびPMA処理サンプルの分析から生成された各種データ出力を探索し、比較します。次に、結果データテーブルCSVファイルを起動して単一細胞データを探索し、結果PDFファイルをクリックして、サンプル内のNETエリア分布とDNA対NET比を視覚化します。赤い線はグラフのしきい値を示します。最後に、結果の二変量分布ファイルをクリックして、NET領域とDNAの形状を決定します。ここでは、制御好中球の15画像およびPMA刺激好中球の15画像を10分以内に分析した。細胞の総数をカウントし、好中球外細胞トラップを有する細胞の割合は、この記事で説明した自動化された定量方法を使用して決定した。これらの結果は、PMA刺激性好中球が、コントロールサンプルよりも大きな面積、核変形の増加、およびDNA対NET比が高いことを示している。3D グラフに組み合わせると、PMA 刺激サンプルは、コントロール サンプルよりも引き締めグループの領域を示す傾向があります。手順を試みる際は、ワークフローは複数のドナーを使用してテストされましたが、個々のデータセットに基づいてソフトウェアパラメータを適切に決定することをお勧めします。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

蛍光免疫顕微鏡を用いたパラフィン組み込みネコリン動脈血栓における好中球外細胞トラップの同定

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...