Name: automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00
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O trabalho foi financiado pela Fundação Crafoord (TM e PN), concessão de Pesquisa do Governo Sueco (PN, TM), conselho de pesquisa sueco (PN) e Groschinsky Foundation (TM, PN).

O comitê de ética da Universidade de Lund aprovou a coleta de sangue venoso de voluntários saudáveis de acordo com a Declaração de Helsínquia (2013/728). Todos os voluntários forneceram seu consentimento informado por escrito.
1. Isolamento de neutrófilos de sangue periféricos usando centrífugação de densidade-gradiente
<ol><li>Coletar sangue venoso humano em tubos contendo heparina e permitir que os tubos para atingir a temperatura ambiente. Nota: Um mínimo de 16 mL de sang...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Sorensen, O. 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K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa.">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+determination+of+NET+(neutrophil+extracellular+traps)+coverage+in+fluorescent+microscopy+images.">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li><li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETQUANT:+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps.">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer.">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li><li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).</li></ol>

A formação NET é uma adição relativamente recente ao diverso armamentarium neutrófilo4 e tem havido uma onda notável de interesse para estudar a implicação de NETs em uma ampla gama de áreas de pesquisa5,7,14,15. A aquisição de imagens usando microscopia de imunofluorescência e quantificação subsequente baseada em imagem é um método amplamente utilizado ...

Neutrófilos são mediadores cruciais de respostas inatas de defesa do hospedeiro contra uma grande variedade de patógenos microbianos1. Eles executam suas funções antimicrobianas liberando seus grânulos contendo uma grande variedade de proteínas antimicrobianas2,produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) e hipoclorite1,e através da fagocitose3. Além disso, Brinkmann et al. 4 descreveram armadilhas extracelulares neutantes (NETs) como um novo mecanismo pelo qual os neutrófilos prendem e eliminam patógenos invasores. Desde a sua descoberta há pouco mais de umadécada,os NETs têm sido implicados numa grande variedade de5,6 e7 morbidadesnãoinfecciosas. A formação líquida é um processo ativo e resulta na extrusão do DNA de cromatina revestido com proteínas antimicrobianas derivadas de grânulo8. Algumas das principais mudanças na morfologia celular e nuclear associadas à formação net incluem a perda de morfologia nuclear, decondensation cromatina, mobilização de proteínas de granule do citoplasma para o núcleo e um aumento no diâmetro nuclear e celular8,9.
Os NETs semelhantes à web, que podem aparecer como estruturas difusas ligeiramente maiores do que a célula ou como estruturas várias vezes maiores do que um único neutrófilo são considerados como indicadores de NETosis5,10. Usando microscopia de fluorescência, nets podem ser detectados por sondagem de DNA com uma sonda fluorescente, como 4',6-diamidino-2-fenilatoladole (DAPI) e por imunofluorescência manchando contra net-bound proteínas como neutrophil elastase. Quantificação de áreas sobrepostas de coloração para DNA e proteínas net-bound determina a área total NETs em uma imagem11.
Uma série de opções de análise de imagem estão disponíveis para realizar quantificação baseada em imagem de fluorescência de NETs11,12. Mas essas opções de software apresentam limitações em não ser amigável e/ou totalmente automatizada. Neste artigo, demonstramos o funcionamento do NETQUANT13, um aplicativo disponível gratuitamente que pode executar quantificação líquida de microfluorescência totalmente automatizada imparcial. O aplicativo tem uma interface gráfica amigável (GUI) e pode realizar análisede célula única. O software quantifica a NETose em uma imagem detectando as mudanças morfológicas na área do marcador ligado ao DNA-NET, a descondensação da cromatina associou a deformação do núcleo e o aumento da relação de proteína dna:NET-bound. Em conjunto, os múltiplos critérios de definição NET permitem uma quantificação líquida rigorosa em vários conjuntos de dados de forma imparcial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10626491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Coverslips 10mm</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>CS10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>631-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary anti-human elastase</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>DAKO rabbit 1373, contract immunization</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11072, A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Zyla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x, 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macOS Sierra 10.12</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant

As armadilhas extracelulares neutrófilas (NETs) são estruturas antimicrobianas semelhantes à teia, consistindo de proteínas antimicrobianas derivadas de DNA e grânulo. A microscopia de imunofluorescência e os métodos de quantificação à base de imagem continuam a ser ferramentas importantes para quantitar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. No entanto, existem limitações fundamentais para os métodos baseados em imunofluorescência que estão atualmente disponíveis para quantificar NETs. Métodos manuais de quantificação NET baseada em imagem são muitas vezes subjetivos, propensos a erros e tediosos para os usuários, especialmente usuários não experientes. Além disso, as opções de software atualmente disponíveis para quantificação são semi-automáticas ou exigem treinamento antes da operação. Aqui, demonstramos a implementação de um método automatizado de quantificação de imagem baseado em imunofluorescência para avaliar a formação NET chamada NETQUANT. O software é fácil de usar e tem uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável ao usuário. Considera parâmetros biologicamente relevantes, como um aumento na área de superfície e dna:net marcador proteína razão, e deformação nuclear para definir a formação NET. Além disso, esta ferramenta é construída como um aplicativo disponível gratuitamente e permite a quantificação e análise de resolução de células únicas.

5 x 105 neutrophils/mL foram semeados em coverslips colocados em uma placa de 12 poços e estimulados com 20 nM PMA ou deixados sem estímulo por 150 min. As amostras foram então manchadas usando anticorpos primários de nêutrons anti-humanos de coelho, anticorpos conjugados de fluorofiforas anticoelho de cabra secundário e DAPI - um corante fluorescente rotulado que mancha DNA (Veja a Tabela de Materiais para obter detalhes). Um mínimo de 5 imagens foram e...

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Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Aqui apresentamos o NETQUANT, uma abordagem totalmente automatizada para quantificar as imagens de NETS e imunofluorescência. Isso ajudará os pesquisadores a fazer análises de imagem comparáveis a partir de dados gerados por vários usuários e condições. As vantagens dessa técnica são a facilidade de uso, análise de dados unicelulares, múltiplos critérios para avaliar a formação de NET e uma análise imparcial de múltiplas imagens.Instale e abra o software de análise. Uma versão atualizada pode ser encontrada no arquivo Zenodo GitHub ou no site do Nordonfelt Lab. Na guia de configuração, escolha uma pasta de origem para análise clicando na opção obter caminho no menu de origem.Selecione a pasta contendo as sequências de imagem a serem analisadas. Novamente, clique na opção obter caminho no menu de destino e selecione a pasta de destino para salvar os dados após a análise de imagem. Em seguida, ao usar imagens de canal separadas, nomeie as pastas do canal para que o canal de DNA corresponda à mancha de DNA nuclear, e o canal NET retrata a mancha de elastase de neutrófilo nas imagens.Além disso, nomeie a pasta contendo os arquivos de imagem de controle como controle. Em seguida, clique no botão de informações de imagem de carga e carregue os metadados de imagem para o software. Em seguida, no subempreso de ordem de canal, selecione a ordem de canal correta contida nas imagens.Isso ajuda a evitar incompatibilidades acidentais. Agora clique no botão preparar dados para adquirir propriedades de imagem primária a partir dos dados brutos e converter as imagens. As imagens convertidas aparecerão no subempresa dos tipos de amostra.Clique no menu de tipo de amostra, selecione uma imagem no subempômo e clique em exibir dados de imagem para exibir as imagens divididas no DNA e na Armadilha Extracelular de Neutrófilos, ou canal NET, respectivamente. Para segmentar as células em seus respectivos canais, selecione a guia do método de segmentação e selecione um método no subempísula do método tanto para o DNA quanto para os canais NET. O método padrão de segmentação é definido como adaptável e é a configuração recomendada.Outras opções estão disponíveis no software, incluindo borda global e chanverse. Uma opção de bacia hidrográfica também foi incluída para ajudar a distinguir entre células estreitamente colocadas ou NETs. Também na guia de segmentação, clique na opção de amostras de controle do segmento.Em seguida, selecione PMA no subem menu do tipo de amostra e clique na opção lote para iniciar a segmentação de todas as imagens incluídas no conjunto de dados. Em seguida, selecione as imagens no menu de tipo de amostra e clique no botão de dados da imagem do display para visualizar e validar as máscaras de imagem binárias tanto para as máscaras DE DNA quanto para NET geradas após a segmentação. Agora, na guia de análise, clique no botão determinar limiar para analisar as amostras de controle.Em seguida, no lado direito, altere o tipo de amostra para PMA e clique no botão obter propriedades celulares para completar a análise das amostras estimuladas. Em seguida, selecione uma imagem no subem menu do tipo de amostra e clique no botão de dados da imagem de exibição para exibir a sobreposição e o número de células e células formadoras de NET na imagem. Comece selecionando a amostra no subempreso tipo de amostra.Imagens individuais podem ser selecionadas no subempreso do tipo de amostra para análise ou todo o lote de imagens pode ser analisado selecionando a opção de lote. Uma vez selecionado, clique no botão analisar NETs para concluir a análise. Ajuste os critérios NET manualmente para produzir resultados ideais para uma determinada amostra.Compare os NETs identificados com as imagens originais para avaliar a qualidade da identificação. Uma vez concluída esta etapa, os critérios NET podem ser aplicados em todas as imagens do conjunto de dados. Quaisquer alterações feitas nos critérios net também são aplicadas simultaneamente a todas as amostras de controle.Inspecione o resumo de dados no subempeso de dados da célula, onde o número de imagens, a contagem de células por imagem e a porcentagem de NETs por imagem são exibidos. Digite a guia de saída para selecionar e visualizar as saídas de resultado. Explore e compare as várias saídas de dados geradas a partir da análise de amostras tratadas com controle e PMA, selecionando a forma da saída e clicando no botão de resultados de saída.Em seguida, inicie o arquivo CSV da tabela de dados de resultados para explorar dados unicelulares e clique nos resultados arquivos PDF para visualizar a distribuição da área NET e a relação DNA para NET nas amostras. A linha vermelha indica o valor do limiar nos gráficos. Por fim, clique no arquivo de distribuição bivariado dos resultados para determinar a área NET versus forma de DNA.Aqui, 15 imagens de neutrófilos de controle e 15 imagens de neutrófilos estimulados pela PMA foram analisadas em menos de dez minutos. O número total de células foi contado e a porcentagem de células com Armadilhas Extracelulares De Neutrófilo foi determinada utilizando o método automatizado de quantificação descrito neste artigo. Esses resultados mostram que os neutrófilos estimulados pelo PMA têm uma área maior, um aumento na deformação nuclear e uma maior proporção de DNA para NET do que as amostras de controle.Quando combinadas em um gráfico 3D, as amostras estimuladas pelo PMA tendem a mostrar áreas de agrupamentos mais apertados do que as amostras de controle. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar que, embora o fluxo de trabalho tenha sido testado usando vários doadores, recomenda-se que o usuário decida sobre os parâmetros do software adequadamente com base no conjunto de dados individuais.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...