Name: automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT at JoVE.com

Работа финансировалась Фондом Crafoord (TM и PN), Шведским правительственным исследовательским грантом (PN, TM), Шведским исследовательским советом (PN) и Фондом Грощинского (TM, PN).

Комитет по этике Лундского университета одобрил сбор венозной крови здоровых добровольцев в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013/728). Все добровольцы предоставили свое письменное информированное согласие.
1. Изоляция нейтрофилов периферической крови с использова...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis:+how+vital+is+it?.">NETosis: how vital is it?.</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa.">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+determination+of+NET+(neutrophil+extracellular+traps)+coverage+in+fluorescent+microscopy+images.">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li><li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETQUANT:+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps.">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer.">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li><li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).</li></ol>

NET формирования является относительно недавним дополнением к разнообразным нейтрофил вооружения4 и наблюдается заметный всплеск интереса к изучению последствий NETs в широком спектре областей исследований5,7,14,<sup class=...

Нейтрофилы являются ключевыми посредниками врожденных ответных мер защиты хозяина против широкого спектра микробных патогенов1. Они выполняют свои антимикробные функции, выпустив свои гранулы, содержащие широкий спектр противомикробных белков2, производство реактивных видов кислорода (ROS) и гипохлорит1, и через фагоцитоз3. Кроме того, Бринкманн и др. 4 описанные нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) как новый механизм, с помощью которого нейтрофилы ловушки и ликвидации вторжения патогенов. С момента своего открытия чуть более десяти лет назад4,NETs были вовлечены в широкий спектр инфекционных5,6 и неинфекционных7 заболеваний. NET формирование является активным процессом и приводит к экструзии хроматина ДНК покрыты гранулы полученных противомикробных белков8. Некоторые из ключевых изменений в клеточной и ядерной морфологии, связанные с образованием NET включают потерю ядерной морфологии, хроматин деденденсации, мобилизация гранул белков от цитоплазмы до ядра и увеличение ядерного и клеточного диаметра8,9.
Веб-подобные NET, которые могут появиться как диффузные структуры немного больше, чем клетка или как структуры в несколько раз больше, чем один нейтрофил рассматриваются в качестве индикаторов NETosis5,10. Используя флуоресценцию микроскопии, NETs могут быть обнаружены путем зондирования ДНК с флуоресцентным зондом, таких как 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и иммунофлуоресцентных окрашивания против NET-связанных белков, таких как нейтрофил эластаза. Количественная оценка перекрывающихся областей окрашивания для ДНК и сетевых белков определяет общую площадь под NET на изображении11.
Ряд вариантов анализа изображений доступны для выполнения флуоресценции изображения на основе количественной оценки NETs11,12. Но эти варианты программного обеспечения представляют ограничения в не удобной и / или полностью автоматизированной. В этой статье мы демонстрируем работу NET'uANT13, свободно доступное приложение, которое может выполнять объективной полностью автоматизированной иммунофлуоресцентной микроскопии микроскопии net количественной оценки. Приложение имеет удобный графический интерфейс (GUI) и может выполнять одноклеточный анализ. Программное обеспечение количественно NETosis в изображении путем обнаружения морфологических изменений в области ДНК-NET-связанных маркер, хроматин обезвреживание связанных деформации ядра и увеличение в ДНК: NET-связанных белка соотношение. В совокупности многочисленные критерии определения NET позволяют беспрекорнарно проводить строгую количественную оценку NET в нескольких наборах данных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10626491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Coverslips 10mm</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>CS10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>631-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary anti-human elastase</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>DAKO rabbit 1373, contract immunization</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11072, A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Zyla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x, 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macOS Sierra 10.12</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) представляют веб-подобные противомикробные структуры, состоящие из ДНК и гранул, полученных противомикробными белками. Иммунофлуоресцентная микроскопия и методы количественной оценки на основе изображений остаются важными инструментами количественной оценки формирования нейтрофилов внеклеточного люка. Тем не менее, существуют ключевые ограничения для иммунофлуоресценции на основе методов, которые в настоящее время доступны для количественной оценки NETs. Ручные методы количественной оценки NET на основе изображений часто субъективны, склонны к ошибкам и утомительны для пользователей, особенно неопытных пользователей. Кроме того, в настоящее время доступные варианты программного обеспечения для количественной оценки являются либо полуавтоматическими, либо требуют обучения перед эксплуатацией. Здесь мы демонстрируем внедрение автоматизированного метода количественной оценки изображений на основе иммунофлуоресценции для оценки формирования NET, называемого NET'uANT. Программное обеспечение является простым в использовании и имеет удобный графический пользовательский интерфейс (GUI). Он рассматривает биологически значимые параметры, такие как увеличение площади поверхности и коэффициент белка маркера ДНК:NET и ядерная деформация для определения образования NET. Кроме того, этот инструмент построен как свободно доступное приложение, и позволяет одноклеточных резолюции количественной и анализа.

5 х 105 нейтрофилов/мл были посеяны на крышки, помещенные в 12-колодую пластину и стимулируемые либо 20 нМ PMA или оставленные нестимулированными в течение 150 мин. Образцы были затем окрашены с использованием первичных кролика анти-человеческих антитела нейтрофилов, в...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT at JoVE.com

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Здесь мы представляем протокол для генерации нейтрофилов внеклеточных ловушек (NET) и операционной NET QuANT, полностью автоматический вариант программного обеспечения для количественной оценки NETs в иммунофлуоресценции изображений.

Автоматизированная количественная оценка нейтрофилов с использованием NET-UANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Здесь мы представляем NET'U'T, полностью автоматизированный подход к количественной оценке NETS и изображений иммунофлюоресценции. Это поможет исследователям в создании сопоставимого анализа изображений на основе данных, генерируемых несколькими пользователями и условиями. Преимуществами этого метода являются простота использования, анализ одноклеточных данных, несколько критериев для оценки формирования NET и объективный анализ нескольких изображений.Установка и открытие программного обеспечения для анализа. Самую модную версию можно найти в архиве Зенодо GitHub или на веб-сайте Лаборатории Нордонфельта. В вкладке настройки выберите папку источника для анализа, нажав на опцию get path в меню источника.Выберите папку, содержащую последовательности изображений, которые будут проанализированы. Опять же, нажмите на опцию get path в целевом меню и выберите целевую папку для сохранения данных после анализа изображений. Далее, при использовании отдельных изображений канала, назовите папки канала так, чтобы канал ДНК соответствовал ядерному пятнам ДНК, а канал NET изображает пятно нейтрофиловой эластазы на изображениях.Кроме того, назовите папку, содержащую файлы изображения управления, как контроль. Затем нажмите кнопку информации о загрузке изображения и загрузите метаданные изображения в программное обеспечение. Затем в подменю заказа канала выберите правильный порядок канала, содержащийся в изображениях.Это помогает предотвратить случайные несоответствия. Теперь нажмите кнопку подготовки данных, чтобы получить основные свойства изображения из необработанных данных и преобразовать изображения. Преобразованные изображения будут отображаться в подменю типов образцов.Нажмите на меню типа образца, выберите изображение из подменю и нажмите на отображение данных изображения для отображения изображений, разделенных на ДНК и нейтрофил внеклеточной ловушки, или NET канал, соответственно. Чтобы сегментировать ячейки в соответствующие каналы, выберите вкладку метода сегментации и выберите метод в подменю метода как для ДНК, так и для каналов NET. Метод сегментации по умолчанию настроен на адаптивный и является рекомендуемой настройкой.Другие варианты доступны в программном обеспечении, включая глобальные края и chanverse. Был также включен вариант водораздела, который поможет провести различие между тесно расположенными ячейками или NETs. Также во вкладке сегментации нажмите на опцию управления сегментом.Затем выберите PMA из подменю типа выборки и нажмите на пакетную опцию, чтобы начать сегментацию всех изображений, включенных в набор данных. Затем выберите изображения в меню типа образца и нажмите на кнопку данных изображения дисплея, чтобы визуализировать и проверить бинарные маски изображения как для ДНК, так и для масок NET, генерируемых после сегментации. Теперь, во вкладке анализа, нажмите на кнопку определения порога для анализа образцов управления.Затем, с правой стороны, измените тип образца на PMA и нажмите кнопку свойства ячейки, чтобы завершить анализ стимулируемых образцов. Затем выберите изображение из подменю типа образца и нажмите кнопку отображения данных изображения для отображения наложения и количества ячеек и ячеек NET, образующих на изображении. Начните с выбора образца из подменю типа образца.Индивидуальные изображения могут быть выбраны из подменю типа образца для анализа или вся партия изображений может быть проанализирована путем выбора варианта партии. После выбора нажмите кнопку анализа NETs для завершения анализа. Отрегулируйте критерии NET вручную, чтобы дать оптимальные результаты для данной выборки.Сравните идентифицированные NETs с исходными изображениями для оценки качества идентификации. После завершения этого шага критерии NET могут применяться во всех изображениях в наборе данных. Любые изменения, внесенные в критерии NET, также одновременно применяются ко всем контрольных образцам.Проинспектировать резюме данных в подменю данных ячейки, где отображается количество изображений, количество ячеек на изображение и процент NETs на изображение. Введите вкладку вывода для выбора и просмотра результатов. Изучите и сравните различные выводы данных, полученные в результате анализа контрольных и обработанных PMA образцов, выбрав форму вывода и нажав на кнопку результатов вывода.Затем запустите файл таблицы данных результатов CSV для изучения одноклеточных данных и нажмите на файлы PDF результатов, чтобы визуализировать распределение области NET и соотношение ДНК к NET в образцах. Красная линия указывает пороговое значение на графиках. Наконец, нажмите на файл распределения bivariate результатов, чтобы определить область NET по сравнению с формой ДНК.Здесь было проанализировано 15 изображений контрольных нейтрофилов и 15 изображений нейтрофилов, стимулируемых ПМА, менее чем за десять минут. Общее количество клеток было подсчитано, и процент клеток с нейтрофиловыми внеклеточными ловушками был определен с помощью автоматизированного метода количественной оценки, описанного в этой статье. Эти результаты показывают, что ПМА-стимулированные нейтрофилов имеют большую площадь, увеличение ядерной деформации, и более высокое соотношение ДНК к NET, чем контрольные образцы.В сочетании с 3D-графиком образцы, стимулируемые ПМА, как правило, показывают области затягивания групп, чем контрольные образцы. При попытке процедуры важно помнить, что, хотя рабочий процесс был протестирован с использованием нескольких доноров, рекомендуется, чтобы пользователь должен принять решение о параметрах программного обеспечения надлежащим образом на основе индивидуального набора данных.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Простой флуоресценция Анализ на Количественное Собачий Нейтрофильная внеклеточной Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Идентификация нейтрофилов Внеклеточных Ловушек в Параффина-embedded Feartline артериальных тромби с использованием иммунофлюоресценционной микроскопии

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Морфологический и композиционный анализ внеклеточных ловушек нейтрофилов, индуцированных микробными и химическими раздражителями

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Количественная оценка комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК из нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием модифицированного сэндвич-ИФА

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...