Name: automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00
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El trabajo fue financiado por la Fundación Crafoord (TM y PN), la beca sueca de investigación gubernamental (PN, TM), el Consejo de Investigación Sueco (PN) y la Fundación Groschinsky (TM, PN).

El comité de ética de la Universidad de Lund aprobó la recolección de sangre venosa de voluntarios sanos de acuerdo con la Declaración de Helsinki (2013/728). Todos los voluntarios proporcionaron su consentimiento informado por escrito.
1. Aislamiento de neutrófilos de sangre periférica usando Centrifugación Density-Gradient
<ol><li>Recoger sangre venosa humana en tubos que contienen heparina y permitir que los tubos alcancen la temperatura ambiente. Nota: Se requiere un mínimo d...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte.">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis:+how+vital+is+it?.">NETosis: how vital is it?.</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa.">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+determination+of+NET+(neutrophil+extracellular+traps)+coverage+in+fluorescent+microscopy+images.">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li><li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETQUANT:+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps.">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer.">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li><li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).</li></ol>

La formación NET es una adición relativamente reciente al diverso armamentario de neutrófilos4 y ha habido una notable oleada de interés para estudiar la implicación de los NETs en una amplia gama de áreas de investigación5,7,14,15. La adquisición de imágenes mediante microscopía de inmunofluorescencia y la cuantificación posterior basada en imágenes es un m?...

Los neutrófilos son mediadores cruciales de las respuestas de defensa innatas del huésped contra una amplia variedad de patógenos microbianos1. Ejecutan sus funciones antimicrobianas liberando sus gránulos que contienen una amplia gama de proteínas antimicrobianas2,produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS) e hipoclorito1,y a través de fagocitosis3. Además, Brinkmann et al. 4 describió las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) como un mecanismo novedoso por el cual los neutrófilos atrapan y eliminan los patógenos invasores. Desde su descubrimiento hace poco más de una década4, los NETs se han implicado en una amplia variedad de infecciosos5,6 y no infeccioso7 morbilidades. La formación de REDES es un proceso activo y da como resultado la extrusión de ADN de cromatina recubierto con proteínas antimicrobianas derivadas de gránulos8. Algunos de los cambios clave en la morfología celular y nuclear asociados con la formación de REDES incluyen la pérdida de morfología nuclear, la descondensación de cromatina, la movilización de proteínas de gránulos desde el citoplasma al núcleo y un aumento en el diámetro nuclear y celular8,9.
Los NET similares a la web, que pueden aparecer como estructuras difusas ligeramente más grandes que la célula o como estructuras varias veces más grandes que un solo neutrófilo se consideran indicadores de NETosis5,10. Mediante la microscopía de fluorescencia, las NET se pueden detectar sondeando el ADN con una sonda fluorescente como 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y por la tinción de inmunofluorescencia contra proteínas ligadas a redes netasas como la aslastasa de neutrófilos. La cuantificación de áreas superpuestas de tinción para ADN y proteínas ligadas a REDES determina el área total bajo NETs en una imagen11.
Hay varias opciones de análisis de imágenes disponibles para realizar la cuantificación basada en imágenes por fluorescencia de los NET11,12. Pero estas opciones de software presentan limitaciones para no ser fáciles de usar y/ o totalmente automatizados. En este artículo, demostramos el funcionamiento de NETQUANT13, una aplicación de libre disponibilidad que puede realizar una cuantificación NET basada en imágenes basada en imágenes de microscopía de inmunofluorescencia totalmente automatizada imparcial. La aplicación tiene una interfaz gráfica fácil de usar (GUI) y puede realizar análisis de una sola célula. El software cuantifica la NETosis en una imagen mediante la detección de los cambios morfológicos en el área del marcador enlazado a LA RED de ADN, la deformación asociada a la descondensación de cromatina del núcleo y el aumento de la relación de proteínas enlazadas dnalo:NET. En conjunto, los múltiples criterios de definición de NET permiten una cuantificación estricta de NET en varios conjuntos de datos de forma imparcial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparinised plastic tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10626491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Coverslips 10mm</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>CS10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser</td>
			<td>631-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary anti-human elastase</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>DAKO rabbit 1373, contract immunization</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11072, A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E Epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Zyla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x, 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macOS Sierra 10.12</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps using netquant

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras antimicrobianas similares a la web que consisten en proteínas antimicrobianas derivadas del ADN y del gránulo. La microscopía de inmunofluorescencia y los métodos de cuantificación basados en imágenes siguen siendo herramientas importantes para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos. Sin embargo, existen limitaciones clave en los métodos basados en la inmunofluorescencia que actualmente están disponibles para cuantificar los NET. Los métodos manuales de cuantificación de NET basada en imágenes suelen ser subjetivos, propensos a errores y tediosos para los usuarios, especialmente los usuarios no experimentados. Además, las opciones de software disponibles actualmente para la cuantificación son semiautomáticas o requieren capacitación antes de la operación. Aquí, demostramos la implementación de un método automatizado de cuantificación de imágenes basado en inmunofluorescencia para evaluar la formación NET denominada NETQUANT. El software es fácil de usar y tiene una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar. Considera parámetros biológicamente relevantes como un aumento en la superficie y la relación de proteína de marcador DNA:NET, y la deformación nuclear para definir la formación de NET. Además, esta herramienta se construye como una aplicación de libre disposición, y permite la cuantificación y el análisis de la resolución de una sola celda.

5 x 105 neutrófilos/ml fueron sembrados sobre los cubreobjetos colocados en una placa de 12 pocillos y estimulados con PMA de 20 nM o sin estimular durante 150 min. Las muestras se teñían entonces utilizando anticuerpos primarios anti-humanos neutrófilos elastasa, anticuerpos conjugados secundarios con fluoróforo anticonejo de cabra y DAPI - un tinte fluorescentemente etiquetado que mancha el ADN (Ver la Tabla de Materiales para más detalles). A continuac...

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Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Aquí presentamos NETQUANT, un enfoque totalmente automatizado para cuantificar NETS y las imágenes de inmunofluorescencia. Esto ayudará a los investigadores a realizar análisis de imágenes comparables a partir de datos generados por múltiples usuarios y condiciones. Las ventajas de esta técnica son la facilidad de uso, el análisis de datos de una sola célula, múltiples criterios para evaluar la formación de NET y un análisis imparcial de varias imágenes.Instale y abra el software de análisis. Se puede encontrar una versión actualizada en el archivo GitHub de Zenodo o en el sitio web de Nordonfelt Lab. En la pestaña de configuración, elija una carpeta de origen para el análisis haciendo clic en la opción obtener ruta en el menú de origen.Seleccione la carpeta que contiene las secuencias de imágenes que se van a analizar. Una vez más, haga clic en la opción obtener ruta en el menú de destino y seleccione la carpeta de destino para guardar los datos después del análisis de imagen. A continuación, cuando utilice imágenes de canal separadas, asigne un nombre a las carpetas del canal para que el canal de ADN se corresponda con la mancha de ADN nuclear, y el canal NET representa la mancha de elastasa de neutrófilos en las imágenes.Además, asigne un nombre a la carpeta que contiene los archivos de imagen de control como control. A continuación, haga clic en el botón cargar información de imagen y cargue los metadatos de la imagen en el software. A continuación, en el submenú Orden de canal, seleccione el orden de canal correcto contenido en las imágenes.Esto ayuda a evitar desajustes accidentales. Ahora haga clic en el botón preparar datos para adquirir las propiedades de imagen primarias de los datos sin procesar y convertir las imágenes. Las imágenes convertidas aparecerán en el submenú Tipos de muestra.Haga clic en el menú de tipo de muestra, seleccione una imagen del submenú y haga clic en mostrar los datos de la imagen para mostrar las imágenes divididas en el ADN y Neutrophil Trampa extracelular, o canal NET, respectivamente. Para segmentar las celdas en sus respectivos canales, seleccione la pestaña Método de segmentación y seleccione un método en el submenú del método para los canales DNA y NET. El método predeterminado de segmentación se establece en adaptable y es la configuración recomendada.Otras opciones están disponibles en el software, incluyendo borde global y chanverse. También se ha incluido una opción de cuenca hidrográfica para ayudar a distinguir entre células estrechamente colocadas o NEA. También en la pestaña de segmentación, haga clic en la opción de muestras de control de segmento.A continuación, seleccione PMA en el submenú de tipo de muestra y haga clic en la opción de lote para comenzar la segmentación de todas las imágenes incluidas en el conjunto de datos. A continuación, seleccione las imágenes en el menú de tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para visualizar y validar las máscaras de imagen binaria para las máscaras de ADN y NET generadas después de la segmentación. Ahora, en la pestaña de análisis, haga clic en el botón determinar umbral para analizar las muestras de control.Luego, en el lado derecho, cambie el tipo de muestra a PMA y haga clic en el botón Obtener propiedades de celda para completar el análisis de las muestras estimuladas. A continuación, seleccione una imagen del submenú Tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para mostrar la superposición y el número de celdas y celdas de conformar mosquio en la imagen. Comience seleccionando la muestra en el submenú Tipo de muestra.Las imágenes individuales se pueden seleccionar en el submenú de tipo de muestra para el análisis o se puede analizar todo el lote de imágenes seleccionando la opción de lote. Una vez seleccionado, haga clic en el botón analizar NETs para completar el análisis. Ajuste los criterios de NET manualmente para obtener resultados óptimos para una muestra determinada.Compare los NT identificados con las imágenes originales para evaluar la calidad de la identificación. Una vez completado este paso, los criterios de NET se pueden aplicar a todas las imágenes del conjunto de datos. Los cambios realizados en los criterios de NET también se aplican simultáneamente a todos los ejemplos de control.Inspeccione el resumen de datos en el submenú de datos de celda, donde se muestra el número de imágenes, el recuento de celdas por imagen y el porcentaje de NIT por imagen. Introduzca la pestaña de salida para seleccionar y ver las salidas de resultados. Explore y compare las diversas salidas de datos generadas a partir del análisis de muestras de control y tratadas con PMA seleccionando la forma de la salida y haciendo clic en el botón de resultados de salida.A continuación, inicie el archivo CSV de la tabla de datos de resultados para explorar los datos de una sola celda y haga clic en los archivos PDF de resultados para visualizar la distribución del área NET y la relación DNA a NET en los ejemplos. La línea roja indica el valor de umbral en los gráficos. Por último, haga clic en el archivo de distribución bivariada de resultados para determinar el área NET frente a la forma del ADN.Aquí, se analizaron 15 imágenes de neutrófilos de control y 15 imágenes de neutrófilos estimulados por PMA en menos de diez minutos. Se contó el número total de células y se determinó el porcentaje de células con trampas extracelulares de neutrófilos utilizando el método de cuantificación automatizado descrito en este artículo. Estos resultados muestran que los neutrófilos estimulados por PMA tienen un área más grande, un aumento en la deformación nuclear y una relación ADN a NET más alta que las muestras de control.Cuando se combinan en un gráfico 3D, las muestras estimuladas por PMA tienden a mostrar áreas de agrupaciones de apriete que las muestras de control. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que aunque el flujo de trabajo se probó con varios donantes, se recomienda que el usuario decida los parámetros de software adecuadamente en función del conjunto de datos individual.

Research

JoVE Journal

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Simplificado Humanos neutrófilos extracelular Trampas (TNE) Aislamiento y manipulación

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Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...