Name: isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

ونشكر الدكتور محمد الزبير على اقتراحاته المفيدة والمساعدة التقنية في وضع هذا البروتوكول. كان يدعمها هذا العمل في المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي، "معاهد الصحة الوطنية لمنحه بحثية" 2R01-DK062027 (إلى G.D.H).

وأجريت جميع الأساليب وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسياً تحت رعاية "اللجنة الجامعة" في استخدام ورعاية الحيوانات في جامعة ميشيغان.
1-التحضير لعملية جراحية
<ol><li>في اليوم السابق للجراحة، إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA)/الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). في حالة مختبرين المجمدة، انتقل إلى...

<ol>
	<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry.">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Stem/+Progenitor+Cell+Maintenance+in+the+Adrenal+Cortex.">Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Yates, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+Development,+Maintenance,+and+Disease.">Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease.</a> Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).</li><li>Jones, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+Mouse+Adrenal+Cortex+with+Special+Reference+to+the+Zona+Reticularis+and+to+Brown+Degeneration,+Together+with+a+Discussion+of+the+Cell+Migration+Theory.">Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).</li><li>Sucheston, M. E. C., Samuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transient-Zone+in+the+Human+and+Mouse+Adrenal+Gland.">The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland.</a> The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).</li><li>Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Sonic+hedgehog+secreting+and+receiving+cells+in+the+developing+and+adult+rat+adrenal+cortex.">Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).</li><li>Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+zonation,+renewal,+and+remodeling.">Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Finally+Get+a+Little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li><li>Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+steroidogenic+cells.">Lipid droplets and steroidogenic cells.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).</li><li>Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+steroidogenesis.">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stevens &amp; Lowe's Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).</li><li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+for+human+catecholamine-synthesizing+enzymes.">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li><li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function.">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li><li>Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+methods+for+immunohistochemistry.">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorometric+determination+of+the+stable+state+of+aggregation+in+hemoglobins.">Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins.</a> Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue.">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).</li><li>Watson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+autofluorescence+of+erythrocytes.">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li></ol>

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل الغدد الكظرية الماوس جنبا إلى جنب مع الإعداد وتلطيخ للغدة الكظرية مقطعة الماوس جزءا لا يتجزأ من البارافين.
بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى نحن اختبار، أثبت هذا البروتوكول الفلورة مناسبة لمعظم الأجسام المضادة المستخدمة في المختبر. ومع ذلك، ...

إيمونوهيستوتشيميستري أسلوب للكشف عن مكونات النسيج باستخدام أجسام مضادة محددة من الجزيئات الخلوية وتقنيات المصبوغة اللاحقة للكشف عن الأجسام المضادة مترافق1. يتطلب هذا الإجراء المناعي التثبيت المحددة وتجهيز الأنسجة التي تتحدد غالباً تجريبيا مستضد معين، استخدام أنسجة وجسم2. تثبيت أمر حاسم للحفاظ على حالة الأنسجة وبالتالي الحفاظ على هياكل سوبسيلولار والخلوية سليمة وأنماط التعبير "الأصلي". كذلك تجهيز وتضمين إجراءات مطلوبة لإعداد الأنسجة لتمزيقها إلى شرائح رقيقة التي يتم استخدامها لدراسات نسيجية التي تنطوي على إيمونوهيستوتشيميستري.
يمكن إجراء إيمونوستاينينج مع الكشف اللونية أو الفلورسنت. كشف اللونية يتطلب استخدام إنزيم تحويل ركيزة القابلة لذوبان إلى منتج ملونة غير قابلة للذوبان. بينما يمكن مترافق هذا الإنزيم إلى جسم إذ تسلم المستضد (جسم الأولية)، هو أكثر في كثير من الأحيان مترافق بجسم الاعتراف بجسم الأولية (أي، جسم الثانوي). هذا الأسلوب حساسة للغاية؛ المنتج الملونة الناتجة عن رد فعل الانزيمية فوتوستابل ويتطلب إلا مجهر برايتفيلد للتصوير. ومع ذلك، إيمونوستينينج اللونية قد لا تكون مناسبة عندما تحاول أن تصور البروتينات هما ترجمة المشترك، نظراً للترسب لون واحد يمكن أن تخفي ترسب واحدة أخرى. في حالة الاشتراك تلطيخ، أثبت الفلورة لتكون أكثر فائدة. ويعزى ظهور الفلورة "ألبرت كونس" وزملائه، الذين وضعت نظاما لتحديد المستضدات الأنسجة مع الأجسام المضادة التي تحمل فلوريسسين وتصور لهم في الأنسجة مقطعة تحت الضوء فوق البنفسجي3. وتستند الأسفار الكشف عن جسم مترافق مع فلوروفوري التي تنبعث الضوء بعد الإثارة. لأن هناك عدة فلوروفوريس مع الانبعاثات عند أطوال موجية مختلفة (مع تداخل قليلاً أو لا)، طريقة الكشف عن هذا المثل الأعلى للدراسات الخاصة بالبروتينات متعددة.
الغدة الكظرية جهاز المزدوجة الموجودة فوق الكلي، وتتميز بعنصرين متميزين امبريولوجيكالي محاطة بكبسولة الوسيطة. قشرة الغدة الكظرية الخارجي، المستمدة من ميسوديرم المتوسطة ميسونيفريك، تفرز هرمونات الستيرويد بينما تنتج لب الداخلية، المستمدة من قمة العصبية، الكاتيشولامين بما فيها الأدرينالين ونورادرينالين والدوبامين. قشرة الغدة الكظرية ينقسم الأشيع ووظيفيا في ثلاث مناطق متحدة المركز، مع كل منطقة إفراز فئات مختلفة من هرمونات الستيرويد: الخارجي zona glomerulosa (زج) تنتج مينيرالوكورتيكويدس التي تنظم التوازن المنحل بالكهرباء و حجم داخل الأوعية؛ فاسسيكولاتا زونا الأوسط (zF)، مباشرة تحت زج، تفرز الكورتيزون التي تتوسط استجابة الإجهاد من خلال تعبئة مخازن الطاقة لزيادة جلوكوز البلازما؛ وقد زونا الداخلية (zR)، الذي يجمع الجنس السلائف الستيرويد (أي، وديهيدرو (داس))4.
يوجد بعض الاختلاف في تقسيم البطاني بين الأنواع: فعلى سبيل المثال، يفتقر موس موسكولوس zR. العاشر بعد الولادة الفريدة-منطقة موسكولوس م. من بقايا من قشرة الجنين تتميز بالخلايا الدهنية-الفقراء الصغيرة مع سيتوبلاسمس acidophilic5. س-المنطقة يختفي في سن البلوغ في الفئران الذكور وبعد الحمل الأول في الفئران الإناث، أو يتدهور تدريجيا في الإناث التي ولدت عدم6،7. وعلاوة على ذلك، تورتوسيتي وسمك المعروضات زج علامة التباين بين الأنواع كما يفعل منظمة للخلايا الجذعية والسلف المحيطية في وزج المناطق المجاورة لها. الفئران، خلافا لسائر القوارض، لدى منطقة غير متمايزة مرئية (زو) بين زج و zF التي تعمل كمنطقة خلايا الجذعية و/أو منطقة عابرة تضخيم موروث. ما إذا كان زو فريدة من نوعها للفئران أو ببساطة أكثر بارزة نظمت مجموعة من الخلايا هو غير معروف8،9.
تحتوي الخلايا للقشرة الكظرية قطرات الدهن التي تخزن استرات الكوليسترول التي تكون بمثابة مقدمة لجميع هرمونات الستيرويد10،11.  ويعرف مصطلح "ستيرويدوجينيسيس" عملية إنتاج هرمونات الستيرويد من نسبة الكولسترول في الدم عن طريق سلسلة من التفاعلات الانزيمية التي تنطوي على نشاط عامل ستيرويدوجينيك 1 (SF1)، التعبير الذي علامة على إمكانات ستيرويدوجينيك. في الغدة الكظرية، التعبير Sf1 موجودة فقط في خلايا اللحاء12. دراسة مثيرة لاهتمام وجدت التعبير عن البيوتين الذاتية في الخلايا البطاني مع احتمال ستيرويدوجينيك13. بينما يمكن أن يكون هذا سبب خلفية أعلى في أساليب المصبوغة البيوتين/المستندة إلى ستريبتافيدين، بسبب الكشف عن البيوتين الذاتية بجسم مترافق مع streptavidin، وهذه الخاصية يمكن استخدامها أيضا للتمييز في ستيرويدوجينيك خلايا من السكان الآخرين داخل الغدة الكظرية، أي، بطانية، والحافظة، وخلايا لب.
معصب من يتعاطف مع الخلايا العصبية بريجانجليونيك، الكظر تتسم بالخلايا باسوفيليك مع السيتوبلاسما حبيبية تتضمن أدرينالين وإفراز. خلايا لب تسمى "تشرومافين" بسبب ارتفاع محتوى الكاتيشولامين التي تشكل صبغة بني بعد أكسدة14. Hydroxylase التيروزين (TH) هو الإنزيم الذي يحفز الخطوة الحد من معدل في تركيب الكاتيشولامين، وفي الغدة الكظرية، وهو أعرب عن فقط في لب15.
نقدم هنا بروتوكولا لعزل الماوس الغدد الكظرية، تجهيزها للتضمين في البارافين وتمزيقها وأسلوب أداء الفلورة تلطيخ في الفروع الكظرية بغية التعرف على أنواع الخلايا التي تشكل قشرة الغدة الكظرية ولب. هذا البروتوكول معيار في المختبر إيمونوستينينج مع الأجسام المضادة متعددة تستخدم بشكل روتيني في بحوثنا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:156px;">Nest Biotechnology Co.</td>
			<td style="width:119px;">0412B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable needles 25Gx5/8&#34;</td>
			<td style="width:156px;">Exel International</td>
			<td style="width:119px;">26403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraplast plus&#160;</td>
			<td style="width:156px;">McCormik scientific</td>
			<td style="width:119px;">39502004</td>
			<td>Paraffin for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shandon biopsy cassettes II with attached lid</td>
			<td style="width:156px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">1001097</td>
			<td>Cassettes for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Edge</td>
			<td style="width:119px;">4685</td>
			<td>Disposable stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds</td>
			<td style="width:156px;">Polysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18986</td>
			<td>Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X5P1GAL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:156px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Certi-Pad Gauze pads&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Certified Safety Mfg, Inc</td>
			<td style="width:119px;">231-210</td>
			<td>3&#34;x3. Sterile latex free gauze pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M.O.M kit&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BMK-2202</td>
			<td>For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:156px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Wipes 4.4x8.4 inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super PAP PEN</td>
			<td style="width:156px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">00-8899</td>
			<td>Pen to draw on slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover glass&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td>Size: 22x50x1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542&#160;</td>
			<td>(Prepared in 20mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:156px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>Mounting agent for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-cite series 120Q</td>
			<td style="width:156px;">Lumen Dynamics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coolsnap Myo</td>
			<td style="width:156px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optiphot-2&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microtome</td>
			<td style="width:156px;">Americal Optical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue embedder</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">EG1150 H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue processor&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">ASP300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-TH</td>
			<td style="width:156px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB318</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-SF1</td>
			<td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td>
			<td style="width:119px;">&#160;custom made</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa-488 Mouse IgG&#160; raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003&#160;</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-505-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrate acid anhydrous</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A940-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NIS-Elements Basic Research&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands

تقنية راسخة للكشف عن المستضدات في الأنسجة مع عمل الأجسام المضادة مترافق fluorochrome الفلورة ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات. الكشف عن المستضدات يسمح لتوصيف وتحديد العديد من أنواع الخلايا. تقع فوق الكليتين ومغلفة بطبقة من الخلايا الوسيطة، الغدة الكظرية جهاز الغدد الصماء تتألف من اثنين من أنسجة مختلفة مع مختلف الأصول الجنينية وميسونيفريك المتوسطة mesoderm-مشتقة الخارجي قشرة العصبية لب الداخلية المستمدة من كريست. تفرز قشرة الغدة الكظرية المنشطات (أي، مينيرالوكورتيكويدس، والكورتيزون، الهرمونات الجنسية)، في حين الكظر تنتج الكاتيشولامين (أي، الأدرينالين، نورادرينالين). أثناء إجراء البحوث الغدة الكظرية، من المهم أن تكون قادرة على التمييز بين خلايا فريدة من نوعها مع وظائف مختلفة. هنا نقدم بروتوكول وضعت في المختبر الذي يصف سلسلة من الخطوات المتسلسلة المطلوبة للحصول على تلطيخ الفلورة لوصف أنواع خلايا الغدة الكظرية. ونحن نركز أولاً على تشريح الغدد الكظرية الماوس، إزالة الدهون بيريادرينال متبوعاً بالتثبيت، وتجهيز وتضمين البارافين الأنسجة المجهرية. ثم يصف لنا تقطيع كتل الأنسجة مع مبضع دوارة. وأخيراً، نحن تفاصيل بروتوكول لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت الغدد الكظرية التي قمنا بتطوير لتقليل جسم غير محددة ملزمة وأوتوفلوريسسينسي من أجل تحقيق إشارة أمثل.

ويمثل الشكل 1 تخطيطي بروتوكول كامل الموصوفة أعلاه. الغدد الكظرية يتم حصادها من الفئران وتتم إزالة الأنسجة الدهنية المجاورة تحت مجهر تشريح الغدة الكظرية ثم ثابتة في 4% منهاج عمل بيجين. بعد هذه الخطوة، معالجة الغدة الكظرية وجزءاً لا يتجزأ من البارافين، ومقط...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

هنا نقدم طريقة لعزل الغدد الكظرية من الفئران، وإصلاح الأنسجة، وقسم منهم، وأداء تلطيخ الفلورة.

العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

إنّ الفلور المناعية هي طريقة أساسية يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الغدة الكظرية حول تقسيم الكظرية وهوية الخلية والوظيفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة البروتينات المتعددة مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة الكظرية. لإزالة الغدة الكظرية مورين، وقطع حول الأنسجة الدهنية المحيطة ووضع الغدة في بئر واحد من لوحة متعددة 24 التي تحتوي على برنامج تلفزيوني جديد على الجليد.نقل الغدة على طبق بيتري أو دعم الزجاج تحت مجهر تشريح واستخدام اثنين من الإبر قياس 25 لإزالة الأنسجة الدهنية المجاورة. عندما تم إزالة كل من الدهون، إصلاح الأنسجة في 4٪ شبهformaldehyde في أربع درجات مئوية مع هزاز لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، شطف الغدة مع ثلاثة غسل 15 دقيقة في أربع درجات مئوية في ملليلتر واحد إلى اثنين من برنامج تلفزيوني جديد في الغسيل.بعد الغسيل الأخير ، قم بتجفيف الغدة في غطستين من الإيثانول المتتابعة عند أربع درجات مئوية مع الهزاز لمدة ساعتين لكل حضانة. لتحضير النسيج الكظري للمعالجة، لف الغدة بالشاش وأرفق الغدة الكظرية في كاسيت مضمّن للأنسجة. ثم، ضع الكاسيت في جرة مليئة بالإيثانول 70٪ لمدة أربع درجات مئوية التخزين حتى المعالجة.لمعالجة الأنسجة، أدخل الكاسيت في معالج الأنسجة للمعالجة كما هو مبين في الجدول. في نهاية البرنامج، نقل الكاسيت إلى محطة تضمين مليئة البارافين ذاب 65 درجة واستخدام زوج من ملقط لفك الشاش. نقل بلطف الغدة الكظرية في الموقف المناسب في وسط قاعدة من العفن تضمين وصب البارافين ذاب على الغدة.ثم، نقل بعناية العفن تضمين إلى علبة تبريد لتسهيل تصلب البارافين. قبل قسمة ب [ميكرومّ] دوارة, صمّم [سري] من مجهر زلقات ووضع الشرائح على 37 درجة مئويّة انزلاق أكثر دفئا. الاستغناء عن حوالي 450 ميكرولترات من نوع autoclaved واحد المياه النقية جدا على كل شريحة وتعيين سمك قطع القسم من microtome إلى خمسة ميكرومتر.قم بتحميل الأنسجة المضمّنة على كتلة القطع وخفض كتلة البارافين حتى تكون العينة على مستوى الوجه مع حافة شفرة المايكروتوم. تدوير عجلة اليد مع إيقاع ثابت، وتنفيذ التشذيب الأولي لإزالة البارافين وفضح الأنسجة الكظرية. ثم، الحصول على خمسة أقسام ميكرومتر من خلال نهاية الغدة الكظرية باستخدام ملقط لنقل كل قسم إلى قطرة الماء على واحدة من الشرائح المسماة مسبقا كما يتم جمعها.بعد التأكد من وجود الأنسجة في الأقسام عن طريق المجهر، جفف الشرائح على الصفيحة الساخنة لمدة ساعتين تقريباً واخبزها بين عشية وضحاها على الأقل على صينية شرائح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى لا يظهر المزيد من الماء. بمجرد التجفيف، قم بتخزين الشرائح في مربع شريحة في درجة حرارة الغرفة. لاسترجاع مستضد المناعة، de-paraffinize الشرائح مع اثنين من خمس دقائق 100٪ غوليين، تليها الإماهة في سلسلة الإيثانول الغمر تنازلي والمياه.بعد غمر الماء، نقل الشرائح إلى حامل الشريحة المعدنية ووضع حامل في منبر من 0.01 هرات الغلي على لوحة ساخنة لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وإزالة الكدر من لوحة ساخنة والسماح لها تبرد لمدة 20 دقيقة، مع الحرص على أن جميع أقسام الغدة الكظرية لا تزال مغطاة العازلة. عندما يتم تبريد الكوبر، نقل الشرائح إلى جرة كوبلين لمدة ثلاثة غسلات لمدة 10 دقائق في PBS الطازجة مع هزاز لطيف.بعد الغسيل الأخير، امسح بعناية سطح كل شريحة دون إتلاف أقسام الأنسجة واستخدم علامة رهاب الماء لجعل دائرة حول كل قسم. ضع الشرائح في غرفة مرطبة وأضف بسرعة 50 ميكرولترات على الأقل من محلول الحجب إلى كل قسم لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد لمدة خمس دقائق لكل غسل مع هزاز والعودة الشرائح إلى الغرفة.بعد ذلك، أضف مزيج الأجسام المضادة الأساسي الذي يهم كل قسم لاحتضانها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، قم بغسل العينات بثلاث غسلات لمدة 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل وتسمية الشرائح مع محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ثلاثة غسل 15 دقيقة على الروك المحمية من الضوء، ووضع علامة على نواة من الأقسام مع DAPI لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء بعد الغسيل الماضي.بعد ثلاثة خمس دقائق برنامج تلفزيوني يغسل مع هزاز، إضافة 60 microliters من عامل تصاعد مناسبة لمناعة الزجاج على طول سطح واحد غطاء الزجاج لكل عينة واضغط بخفة كل شريحة شريحة قسم الأنسجة الجانب إلى أسفل على الزجاج غطاء، مع الحرص على تجنب فقاعات. ثم، وضع كل شريحة مسطحة في حاوية مظلمة لعلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير. خلال عملية إزالة الدهون، من المهم عدم السماح للغدة الكظرية بالجفاف حيث يمكن أن يؤدي الجفاف إلى تلف بنية الأنسجة.بعد إزالة ناجحة من الأنسجة الدهنية المحيطة, يجب أن تكون الغدة الكظرية يمكن اكتشافها بسهولة مع عدم وجود الدهون مرئية إضافية. المناعة من أقسام الغدة الكظرية كما هو موضح يكشف عن عامل الستيرويدية النووية واحدة تلطيخ من الخلايا الغدة الدرقية, تلطيخ التيروزين هيدروكسيلاس من خلايا النخاع, تلطيخ DAPI من نواة الخلايا غير الستيرويدية من الكبسولة الخارجية, وشارك في تلطيخ مع الخلايا الغدة الدرقية ونخاع. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الغدة الكظرية الماوس صغيرة وأن مواقفها متغيرة إلى حد ما مما يجعل اكتشافها صعباً.لذلك ، من المهم أن يكون لديك رؤية واضحة للمنطقة أثناء التشريح. هذه الإجراءات هي التقنيات الأساسية لدراسة الغدة الكظرية في الجسم الحي. وبعد ذلك، يمكن تنفيذ أساليب إضافية لاحتواء المناعة لتلبية احتياجات علمية محددة.بعد تطورها، مهدت المناعة الطريق للباحثين في مجالات العلوم الطبية الحيوية لاستكشاف التعبير البروتيني في الموقع، وهو أداة مفيدة في العديد من التخصصات والمجالات.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

عزل خلايا فأر التجويف البريتوني

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

تهجين<em&gt; في الموقع</em&gt; من الغدد اللعابية والمبيض والأجنة من البعوض الحامل للمرض

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

غير الغازية التصوير الضوئي من الأوعية الدموية اللمفية على فأرة الحاسوب

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

العزلوالتقييم الكمي لخلايا الفرشاة من القصبة الهوائية للفأر

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

عزل الخلايا الظهارية اللعابية من الغدد اللعابية البشرية للنمو في المختبر كما ساليسفيرس أو الطبقات الأحادية

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

غرس ورصد من قبل PET/CT من نموذج المجسم من ورم الظهاره المخروطية البشرية الجنبي في الفئران Athymic

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...