Name: isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Vi takker Dr. Mohamad Zubair for hans nyttige forslag og teknisk bistand ved oprettelsen af denne protokol. Dette arbejde blev støttet af nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyresygdomme, nationale institutter for sundhed Research Grant 2R01-DK062027 (til G.D.H).

Alle metoder blev udført i overensstemmelse med institutionelt godkendte protokoller under auspicier Universitet Udvalget om brug og pleje af dyr på University of Michigan.
1. forberedelse til operation
<ol><li>På dagen forud for operationen, forberede 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) / fosfatbufferet saltopløsning (PBS). I tilfælde af frosne delprøver, fortsætte med at optø en og opbevares ved 4 ° C. Bemærk: 4% PFA er ikke stabil i mere end 48 timer. Forsigtig: PFA er giftige, undg?...

<ol>
	<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry.">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Stem/+Progenitor+Cell+Maintenance+in+the+Adrenal+Cortex.">Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Yates, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+Development,+Maintenance,+and+Disease.">Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease.</a> Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).</li><li>Jones, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+Mouse+Adrenal+Cortex+with+Special+Reference+to+the+Zona+Reticularis+and+to+Brown+Degeneration,+Together+with+a+Discussion+of+the+Cell+Migration+Theory.">Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).</li><li>Sucheston, M. E. C., Samuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transient-Zone+in+the+Human+and+Mouse+Adrenal+Gland.">The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland.</a> The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).</li><li>Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Sonic+hedgehog+secreting+and+receiving+cells+in+the+developing+and+adult+rat+adrenal+cortex.">Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).</li><li>Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+zonation,+renewal,+and+remodeling.">Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Finally+Get+a+Little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li><li>Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+steroidogenic+cells.">Lipid droplets and steroidogenic cells.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).</li><li>Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+steroidogenesis.">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stevens &amp; Lowe's Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).</li><li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+for+human+catecholamine-synthesizing+enzymes.">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li><li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function.">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li><li>Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+methods+for+immunohistochemistry.">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorometric+determination+of+the+stable+state+of+aggregation+in+hemoglobins.">Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins.</a> Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue.">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).</li><li>Watson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+autofluorescence+of+erythrocytes.">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li></ol>

Denne protokol beskriver en metode til isolering af musen binyrerne sammen med udarbejdelsen og farvning af sektioneret paraffin-embedded mus binyrer.
I forhold til andre protokoller, vi testede, bevist protokollens immunofluorescens egnet til fleste af antistoffer bruges i vores laboratorium. Det kan dog i visse tilfælde kræve nogle justeringer til at forbedre farvning resultaterne. En variabel, der kan nemt redigeres og testet er længden af fiksering. I vores laboratorium, inkubation i 4%...

Immunhistokemi er en teknik til at påvise væv komponenter med brug af antistoffer specifikke cellulære molekyler og efterfølgende farvning teknikker til at opdage den konjugerede antistoffer1. Denne immunhistokemiske procedure kræver specifikke fiksering og forarbejdning af væv, der bestemmes ofte empirisk for den specifikke antigen, væv og antistof udnyttet2. Fiksering er afgørende for at bevare den "oprindelige" tilstand af vævet og dermed bevare intakt cellulære og subcellulært strukturer og udtryk mønstre. Yderligere er forarbejdning og indlejring procedurer forpligtet til at forberede væv til skæring i tynde skiver, der bruges til histologiske undersøgelser der involverer Immunhistokemi.
Immunfarvning kan udføres med enten kromogent eller fluorescerende detektion. Kromogent påvisning kræver udnyttelsen af et enzym til at konvertere et opløseligt substrat til en uopløselig farvet produkt. Mens dette enzym kan være konjugeret til antistof anerkende antigen (primære antistof), er det oftere konjugeret til antistof erkendelse af det primære antistof (dvs., de sekundær antistof). Denne teknik er meget følsomt; farvede produktet som følge af enzymatisk reaktion er photostable og kræver kun en brightfield mikroskop til billedbehandling. Dog kan kromogent immunfarvning ikke være egnet, når de forsøger at visualisere to proteiner, der co Lokaliser, da aflejring af én farve kan maskere deposition af den anden. For Co farvning, immunofluorescens har vist sig for at være mere fordelagtig. Fremkomsten af immunofluorescens tilskrives Albert Coons og kolleger, der har udviklet et system til at identificere væv antigener med antistoffer markeret med fluorescein og visualisere dem i sektioneret væv under ultraviolet lys3. Registrering af Fluorescens er baseret på et antistof konjugeret med et fluorophore, der udsender lys efter excitation. Fordi der er flere fluorophores med emissioner på forskellige bølgelængder (med ingen eller lille overlapning), er denne metode til påvisning ideelt for studier af flere proteiner.
Binyrerne er et parret organ placeret over nyrerne og karakteriseret ved to embryologically særskilte komponenter omgivet af en mesenchymale kapsel. Ydre binyrebarken, afledt af mesonephric mellemliggende mesoderm, udskiller steroidhormoner, mens den inderste medulla, afledt af neurale crest, producerer katekolaminer, herunder adrenalin, noradrenalin og dopamin. I binyrebarken er histologisk og funktionelt opdelt i tre koncentriske zoner, med hver zone secernerende forskellige klasser af steroid hormoner: ydre zona glomerulosa (zG) producerer mineralkortikoider, der regulerer elektrolytten homøostase og intravaskulær volumen; den midterste zona fasciculata (zF), udskiller direkte under zG, glukokortikoider, der mægle stressrespons gennem mobilisering af energi butikker at øge plasma glukose; og de indre zona reticularis (zR), som syntetiserer sex steroid prækursorer (dvs., dehydroepiandrosterone (DHEAS))4.
Nogle variation i binyrebarkhormon zonation er til stede mellem arter: for eksempel, Mus musculus mangler zR. Den unikke postnatal X-zone af M. musculus er en rest af føtal cortex karakteriseret ved små lipid-fattige celler med acidophilic cytoplasms5. X-zone forsvinder i puberteten i mandlige mus og efter den første graviditet i hunmus eller degenererer gradvist i ikke-opdrættet hunner6,7. Desuden markeret tortuosity og tykkelse af zG udstiller variation mellem arter, som gør organisationen af perifere stamceller og stamfader celler i og støder op til zG. Rotte, i modsætning til andre gnavere, har en synlig udifferentierede zone (zU) mellem zG og zF der fungerer som en stamcelle zone og/eller en zone af forbigående forstærke stamfaderen. Om zU er unikke for rotter eller blot en mere prominently arrangeret klynge af celler er ukendt8,9.
Celler af binyrebarken indeholder lipid dråber, der gemmer kolesterol estere, der tjener som en forløber for alle steroidhormoner10,11.  Udtrykket "steroidogenesis" definerer processen med produktion af steroidhormoner fra kolesterol via en serie af enzymatiske reaktioner, der involverer aktiviteten af steroidogene faktor 1 (SF1), hvis udtrykket er en markør for steroidogene potentiale. I binyrerne findes Sf1 udtryk kun i cellerne i cortex12. En interessant undersøgelse fundet udtryk af endogent biotin i binyrebarkhormon celler med steroidogene potentielle13. Mens dette kan være årsag til en højere baggrund i biotin/streptavidin-baserede farvnings-metoder, på grund af påvisning af endogent biotin af antistof konjugeret med streptavidin, kunne denne egenskab anvendes også til at skelne mellem den steroidogene celler fra andre befolkninger i binyrerne, dvs, endotel, kapsulær, og medulla celler.
Innerveres af sympatiske preganglionic neuroner, er binyremarven karakteriseret af baserig celler med en granuleret cytoplasma, der indeholder adrenalin og noradrenalin. Medulla celler er opkaldt "chromaffin" på grund af det høje indhold af katekolaminer, der danner en brun pigment efter oxidation14. Tyrosin hydroxylase (TH) er det enzym, der katalyserer den trafikhastighedsbegrænsning trin i syntesen af katekolaminer og i binyrerne, angives kun i medulla15.
Her præsenterer vi en protokol til isolering af musen binyrerne, deres forarbejdning til indlejring i paraffin og skæring, og en metode til at udføre immunofluorescens farvning på adrenal sektioner for at identificere de cellulære typer, der udgør den adrenal cortex og medulla. Denne protokol er en standard i vores laboratorium for immunfarvning med flere antistoffer rutinemæssigt anvendes i vores forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:156px;">Nest Biotechnology Co.</td>
			<td style="width:119px;">0412B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable needles 25Gx5/8&#34;</td>
			<td style="width:156px;">Exel International</td>
			<td style="width:119px;">26403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraplast plus&#160;</td>
			<td style="width:156px;">McCormik scientific</td>
			<td style="width:119px;">39502004</td>
			<td>Paraffin for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shandon biopsy cassettes II with attached lid</td>
			<td style="width:156px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">1001097</td>
			<td>Cassettes for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Edge</td>
			<td style="width:119px;">4685</td>
			<td>Disposable stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds</td>
			<td style="width:156px;">Polysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18986</td>
			<td>Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X5P1GAL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:156px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Certi-Pad Gauze pads&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Certified Safety Mfg, Inc</td>
			<td style="width:119px;">231-210</td>
			<td>3&#34;x3. Sterile latex free gauze pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M.O.M kit&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BMK-2202</td>
			<td>For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:156px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Wipes 4.4x8.4 inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super PAP PEN</td>
			<td style="width:156px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">00-8899</td>
			<td>Pen to draw on slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover glass&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td>Size: 22x50x1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542&#160;</td>
			<td>(Prepared in 20mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:156px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>Mounting agent for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-cite series 120Q</td>
			<td style="width:156px;">Lumen Dynamics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coolsnap Myo</td>
			<td style="width:156px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optiphot-2&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microtome</td>
			<td style="width:156px;">Americal Optical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue embedder</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">EG1150 H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue processor&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">ASP300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-TH</td>
			<td style="width:156px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB318</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-SF1</td>
			<td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td>
			<td style="width:119px;">&#160;custom made</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa-488 Mouse IgG&#160; raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003&#160;</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-505-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrate acid anhydrous</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A940-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NIS-Elements Basic Research&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands

Immunfluorescens er en veletableret teknik til påvisning af antigen i væv med beskæftigelse af fluorokrom-konjugerede antistoffer og har et bredt spektrum af programmer. Påvisning af antigener giver mulighed for karakterisering og identifikation af flere celletyper. Placeret over nyrerne og indkapslet af et lag af mesenchymale celler, er binyrerne en endokrine organ sammensat af to forskellige væv med forskellige embryologiske oprindelse, mesonephric mellemliggende mesoderm-afledte ydre cortex og de neurale Crest-afledte inderste medulla. Binyrebarken udskiller steroider (dvs., mineralkortikoider, glukokortikoider, kønshormoner), der henviser til, at adrenal medulla producerer katekolaminer (dvs., adrenalin, noradrenalin). Mens adrenal forsker, er det vigtigt at kunne skelne unikke celler med forskellige funktioner. Her giver vi en protokol udviklet i vores laboratorium, der beskriver en række sekventielle trin, der kræves for at opnå immunofluorescens farvning at karakterisere celletyper af binyrerne. Først fokuserer vi på dissektion af binyrerne mus mikroskopiske fjernelse af periadrenal fedt efterfulgt af fiksering, forarbejdning og paraffin indlejring af væv. Derefter beskriver vi, skæring af væv blokke med en Rotationsmikrotom. Endelig, vi detalje en protokol for immunfluorescent farvning af binyrerne, som vi har udviklet for at minimere både ikke-specifikke antistof bindende og autofluorescence for at opnå et optimalt signal.

Figur 1 repræsenterer en skematisk af hele protokollen beskrevet ovenfor. Binyrerne er høstet fra mus, tilstødende fedtvæv fjernes under et dissekere mikroskop og adrenal er så fast i 4% PFA. Efter dette trin, er binyrer behandlet og indlejret i paraffin, og snit med en mikrotom at skære orglet i tynde skiver, der er deponeret på objektglas. Efter tørring af sektionerne, immunofluorescens udføres, og sektionerne er afbildet på mikroskopet.
<p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Her vil vi præsentere en metode til at isolere binyrerne fra mus, lave væv, afsnit dem og udføre immunofluorescens farvning.

Isolation, fiksering og immunfluorescens billeddannelse af musen binyrerne

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunofluorescens er en grundlæggende metode, der kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i binyrefeltet om binyrezonation, celleidentitet og funktion. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for undersøgelse af flere proteiner og samtidig bevare morfologien af binyrevæv. For at fjerne murine binyrekirtlen, skæres omkring det omgivende fedtvæv og placere kirtel i en brønd af en 24-multiwell plade, der indeholder frisk PBS på is.Overfør kirtlen på en petriskål eller glasstøtte under et dissekerende mikroskop, og brug to 25 gauge nåle til at fjerne det tilstødende fedtvæv. Når alt fedtet er fjernet, fastgør vævet i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius med vuggende i to timer. Ved slutningen af inkubationen skylles kirtlen med tre 15-minutters vask ved fire grader Celsius i en til to milliliter frisk PBS pr. vask.Efter den sidste vask, dehydrere kirtlen i to sekventielle ethanol nedsænkning ved fire grader Celsius med vuggende i to timer pr inkubation. For at forberede binyrevæv til behandling, wrap kirtel i gaze og vedlægge binyre i en væv-indlejring kassette. Derefter placere kassetten i en krukke fyldt med 70% ethanol i fire grader Celsius opbevaring indtil forarbejdning.For at behandle vævet skal kassetten indsættes i vævsprocessoren til behandling som angivet i tabellen. I slutningen af programmet, overføre kassetten til en indlejring station fyldt med smeltet 65 graders paraffin og bruge et par vicesser til at pakke gaze. Forsigtigt overføre binyrerne i den rette position i midten af bunden af indlejring skimmel og hæld den smeltede paraffin på kirtlen.Derefter forsigtigt flytte indlejring støbeform til en kølebakke for at lette hærdning af paraffin. Før du afsnitter med roterende mikrotom, skal du mærke en række mikroskopdias og lægge objektglassene på en 37 grader Celsius-slidevarmer. Dispensere omkring 450 mikroliter af autoklavede type et ultra rent vand på hvert dias og indstille afsnittet skæretykkelse af mikrotom til fem mikrometer.Læg det indlejrede væv på skæreblokken, og sænk paraffinblokken, indtil prøven er i ansigtsniveau med mikrotombladets kant. Dreje håndhjulet med en stabil rytme, udføre en indledende trimning for at fjerne paraffin og udsætte binyrevæv. Derefter erhverve fem mikrometer sektioner gennem slutningen af binyrerne ved hjælp af kraftbefængte at overføre hver sektion i vanddråbe på en af de formærkede dias, som det er indsamlet.Efter at have bekræftet tilstedeværelsen af væv i sektionerne ved mikroskopi, tør dias på varmepladen i omkring to timer og bag dem mindst natten over på en slide bakke ved 37 grader Celsius, indtil der ikke mere vand er synlig. Når det er tørt, opbevares objektglassene i en glideboks ved stuetemperatur. For immunfluorescensantigenudtagning paraffiniseres diasene med to fem minutters 100%xylensænkning, efterfulgt af rehydrering i en faldende ethanol- og vandnedsænkningsserie.Efter vandsænkning overføres objektglassene til en metalslideholder, og holderen i et bægerglas med kogende 0,01 molarcitrat på en kogeplade i 10 minutter. I slutningen af inkubationen skal du fjerne bægerglasset fra kogepladen og lade det køle af i 20 minutter, idet det skal sikres, at alle binyrerne stadig er dækket med buffer. Når bægerglasset er afkølet, skal du overføre rutsjebanerne til en Coplin-krukke i tre 10-minutters vaske i frisk PBS med blid rokkende.Efter den sidste vask tørres overfladen af hvert objektglas forsigtigt af uden at beskadige vævssektionerne, og brug en hydrofobe markør til at lave en cirkel omkring hver sektion. Placer objektglas i et befugtet kammer og hurtigt tilføje mindst 50 mikroliter af blokerende opløsning til hver sektion for en times inkubation ved stuetemperatur. Ved afslutningen af blokeringsinkubationen vaskes objektglassene tre gange i frisk PBS i fem minutter pr. vask med gynger og returdias til kammeret.Dernæst tilføje den primære antistof cocktail af interesse til hver sektion for en overnatning inkubation ved fire grader Celsius. Næste morgen vaskes prøverne med tre 15 minutters vask i frisk PBS pr. vask, og rutsjebanerne mærkes med den passende sekundære antistofopløsning i en time beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning vaskes prøverne med tre 15 minutters vask på en rocker, der er beskyttet mod lys, og som mærker kernerne i sektionerne med DAPI i syv minutter ved stuetemperatur, der er beskyttet mod lys efter den sidste vask.Efter tre fem minutters PBS vasker med rokkende, tilsættes 60 mikroliter monteringsmiddel egnet til immunfluorescens langs overfladen af en dækglas pr prøve og let trykke hver slide væv sektion side ned på et dæksel glas, idet pas på at undgå bobler. Derefter lå hver slide fladt i en mørk beholder til hærdning ved stuetemperatur i mindst 24 timer før billeddannelse. Under fedt fjernelse proces, Er det afgørende ikke at lade binyrerne tørre ud som dehydrering kan skade vævsstrukturen.Efter en vellykket fjernelse af det omgivende fedtvæv bør binyrerne let påvises uden ekstra synligt fedt. Immunostaining af binyrerne sektioner som påvist afslører nukleare steroidogene faktor en farvning af adrenocortical celler, tyrosin hydroxylase farvning af medullær celler, DAPI farvning af kerner af ikke-steroidogene celler i den ydre kapsel, og co-farvning med adrenocortical og medullær celler. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at museanerne er små, og at deres positioner er noget varierende, hvilket gør deres opdagelse vanskelig.Derfor er det afgørende at have et klart overblik over området under dissektionen. Disse procedurer er grundlæggende teknikker til undersøgelse af binyrerne in vivo. Efter disse, yderligere metoder til immunstaining kan udføres for at opfylde specifikke videnskabelige behov.Efter sin udvikling banede immunstaining vejen for forskere inden for biomedicinsk videnskab for at udforske in situ proteinudtryk, et nyttigt redskab inden for mange discipliner og områder.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering af Mouse Lung dendritiske celler

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Af spytkirtler, æggestokke og embryoner af Vector Myg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Billeddannelse af mus popliteale lymfeknude

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Ikke-invasiv optisk billeddannelse af lymfatisk vaskulatur på en mus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering af lymfocytter fra Mouse Genital Tract mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Time-lapse 3D Imaging af fagocytose af musen makrofager

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Isolering og kvantitativ vurdering af børste celler fra mus Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Isolering af spyt Epiteliale celler fra humane spytkirtler til in vitro-vækst som Salisfærer eller Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

Implantation og overvågning af PET/CT af en Ortotopisk model af humant pleural Mesothelioma i Athymic mus

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...