Name: isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Nous remercions le Dr Mohamad Zubair pour ses suggestions utiles et assistance technique dans la mise en place du présent protocole. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Diabetes et Digestive and Kidney Diseases, instituts nationaux de santé recherche Grant 2R01-DK062027 (à Gadio).

Toutes les méthodes ont été réalisés conformément aux protocoles approuvés sur le plan institutionnel sous les auspices du Comité universitaire sur l’utilisation et l’entretien des animaux à l’Université du Michigan.
1. préparation pour la chirurgie
<ol><li>Le jour avant la chirurgie, préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) / tampon phosphate salin (PBS). Dans le cas des aliquotes congelés, procéder à un dégel et conserver à 4 ° C. NOTE : 4 % PFA n’est pas stable p...

<ol>
	<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry.">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+steroidogenesis.">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stevens &amp; Lowe's Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).</li><li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+for+human+catecholamine-synthesizing+enzymes.">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li><li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function.">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li><li>Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+methods+for+immunohistochemistry.">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li><li>Billinton, N., Knight, A. 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C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue.">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).</li><li>Watson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+autofluorescence+of+erythrocytes.">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li></ol>

Ce protocole décrit une méthode pour l’isolement des glandes surrénales de souris ainsi que de la préparation et la coloration des glandes surrénales de souris de paraffine sectionnés.
Comparé à d’autres protocoles que nous avons testé, ce protocole immunofluorescence s’est avéré convenant à la plupart des anticorps utilisés dans notre laboratoire. Toutefois, dans certains cas, il peut exiger des ajustements pour améliorer les résultats de coloration. Une variable qui peut...

Immunohistochemistry est une technique de détection de composants tissulaires avec l’utilisation d’anticorps dirigés contre des molécules cellulaires spécifiques et des techniques de coloration ultérieures pour détecter les anticorps conjugués1. Cette procédure d’immunohistochemical nécessite une fixation spécifique et traitement des tissus qui sont souvent empiriquement déterminées pour l’antigène spécifique, les tissus et les anticorps utilisés2. La fixation est essentielle préserver l’état « original » du tissu et ainsi maintenir intact cellulaires et des structures subcellulaires et profils d’expression. Plus de traitement et d’incorporation des procédures sont tenus de préparer le tissu pour la coupe en tranches fines qui sont utilisés pour les études histologiques concernant l’immunohistochimie.
Immunomarquage peut être effectuée avec détection chromogénique ou fluorescente. Détection chromogénique nécessite l’utilisation d’une enzyme pour convertir un substrat soluble en un produit coloré insoluble. Alors que cette enzyme peut se conjuguer à l’anticorps reconnaissant l’antigène (anticorps primaire), il est plus souvent conjugué à l’anticorps reconnaissant l’anticorps primaire (c.-à-d., l’anticorps secondaire). Cette technique est très sensible ; le produit coloré résultant de la réaction enzymatique est photostable et nécessite seulement un microscope à fond clair pour l’imagerie. Cependant, immunomarquage chromogène peut ne pas convenir lorsque vous essayez de visualiser deux protéines qui co localiser, étant donné que la déposition d’une couleur peut masquer la déposition de l’autre. Dans le cas des taches, immunofluorescence s’est avéré pour être plus avantageux. L’avènement de l’immunofluorescence est attribuée à Albert Coons et ses collègues, qui a mis au point un système permettant d’identifier les antigènes de tissu avec des anticorps marqués à la fluorescéine et les visualiser dans les tissus sectionnés sous lumière ultraviolette3. Détection de fluorescence est issue d’un anticorps conjugué avec un fluorophore qui émet de la lumière après excitation. Parce qu’il y a plusieurs fluorophores avec des émissions aux longueurs d’onde différentes (avec peu ou pas de chevauchement), cette méthode de détection est idéale pour l’étude des protéines multiples.
La glande surrénale est un organe jumelé situé au-dessus du rein et se caractérise par deux éléments Embryologiquement distinctes, entourés par une capsule mésenchymateuse. Le cortex surrénalien externe, dérivé du mésoderme intermédiaire mésonéphriques, sécrète des hormones stéroïdes alors que la médullaire interne, dérivée de la crête neurale, produit des catécholamines dont l’adrénaline, la noradrénaline et la dopamine. Le cortex surrénalien est histologiquement et fonctionnellement divisé en trois zones concentriques, chaque zone sécrétant des différentes classes d’hormones stéroïdes : la zone extérieure glomérulée (zG) produit des minéralocorticoïdes qui régulent l’homéostasie de l’électrolyte et volume intravasculaire ; le milieu zona fasciculata (zF), directement sous le zG, sécrète des glucocorticoïdes médiateurs de la réponse au stress par la mobilisation des réserves énergétiques pour augmenter le taux de glucose plasmatique ; et les reticularis de zona interne (zR), qui synthétise le sexe précurseurs stéroïdes (c.-à-d., la déhydroépiandrostérone (SDHEA))4.
Certaines variations dans la corticosurrénale zonation sont présente entre les espèces : par exemple, Mus musculus manque le zR. L’unique zone X postnatale de M. musculus est un vestige du cortex foetal caractérisé par des petites cellules pauvres en lipides avec cytoplasmes acidophiles5. La zone X disparaît à la puberté chez les souris mâles et après la première grossesse chez les souris femelles, ou dégénère progressivement dans les femelles de race n’est pas6,7. En outre, la tortuosité et l’épaisseur des pièces zG marqué la variation entre les espèces comme le fait l’Organisation des cellules souches et progénitrices périphériques dans et à côté de la zG. Le rat, à la différence des autres rongeurs, dispose d’une zone visible indifférenciée (zU) entre le zG et zF qui fonctionne comme une zone de cellules souches et/ou une zone transitoire amplifier les progéniteurs. Si la zone d’incertitude est unique à des rats ou simplement plus organisés en évidence amas de cellules sont inconnue8,9.
Les cellules du cortex surrénal contiennent des gouttelettes de lipides qui stockent des esters de cholestérol qui servent comme le précurseur de toutes les hormones stéroïdes10,11.  Le terme « stéroïdogenèse » définit le processus de production des hormones stéroïdes de cholestérol via une série de réactions enzymatiques qui impliquent l’activité du facteur stéroïdogénique 1 (SF1), dont l’expression est un marqueur potentiel stéroïdogènes. Dans la glande surrénale, expression Sf1 est présente uniquement dans les cellules du cortex12. Une étude intéressante a trouvé l’expression de la biotine endogène dans les cellules corticosurrénales avec potentiel stéroïdogène13. Tandis que cela peut être la cause d’une formation supérieure en méthodes de coloration basé/streptavidine-biotine, en raison de la détection de biotine endogène par l’anticorps conjugué avec la Streptavidine, cette caractéristique pourrait être aussi employée pour distinguer le stéroïdogènes cellules des autres populations au sein de la glande surrénale, c.-à-d., endothélial, capsulaire et cellules de la moelle.
Innervé par les neurones préganglionnaires sympathiques, la médullosurrénale est caractérisée par des cellules basophiles avec un cytoplasme granulaire contenant de l’épinéphrine et la norépinéphrine. Cellules de la moelle sont nommés « chromaffines » en raison de la forte teneur des catécholamines qui forment un pigment brun après oxydation14. Tyrosine hydroxylase (TH) est l’enzyme qui catalyse l’étape cinétiquement limitante dans la synthèse des catécholamines et, dans la glande surrénale, s’exprime uniquement dans la médulla15.
Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des glandes surrénales de souris, leur traitement pour l’enrobage de paraffine et de sectionnement et une méthode pour exécuter immunofluorescence souillant sur sections surrénales afin d’identifier les types cellulaires qui constituent la cortex surrénal et la moelle. Ce protocole est une norme dans notre laboratoire pour l’immunohistochimie avec des anticorps multiples utilisés couramment dans nos recherches.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:156px;">Nest Biotechnology Co.</td>
			<td style="width:119px;">0412B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable needles 25Gx5/8&#34;</td>
			<td style="width:156px;">Exel International</td>
			<td style="width:119px;">26403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraplast plus&#160;</td>
			<td style="width:156px;">McCormik scientific</td>
			<td style="width:119px;">39502004</td>
			<td>Paraffin for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shandon biopsy cassettes II with attached lid</td>
			<td style="width:156px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">1001097</td>
			<td>Cassettes for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Edge</td>
			<td style="width:119px;">4685</td>
			<td>Disposable stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds</td>
			<td style="width:156px;">Polysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18986</td>
			<td>Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X5P1GAL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:156px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Certi-Pad Gauze pads&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Certified Safety Mfg, Inc</td>
			<td style="width:119px;">231-210</td>
			<td>3&#34;x3. Sterile latex free gauze pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M.O.M kit&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BMK-2202</td>
			<td>For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:156px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Wipes 4.4x8.4 inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super PAP PEN</td>
			<td style="width:156px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">00-8899</td>
			<td>Pen to draw on slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover glass&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td>Size: 22x50x1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542&#160;</td>
			<td>(Prepared in 20mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:156px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>Mounting agent for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-cite series 120Q</td>
			<td style="width:156px;">Lumen Dynamics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coolsnap Myo</td>
			<td style="width:156px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optiphot-2&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microtome</td>
			<td style="width:156px;">Americal Optical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue embedder</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">EG1150 H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue processor&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">ASP300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-TH</td>
			<td style="width:156px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB318</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-SF1</td>
			<td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td>
			<td style="width:119px;">&#160;custom made</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa-488 Mouse IgG&#160; raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003&#160;</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-505-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrate acid anhydrous</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A940-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NIS-Elements Basic Research&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands

Immunofluorescence est une technique bien établie pour la détection des antigènes dans les tissus avec l’emploi d’anticorps conjugués fluorochrome et dispose d’un large éventail d’applications. Détection d’antigènes permet la caractérisation et l’identification de plusieurs types de cellules. Située au-dessus des reins et encapsulé par une couche de cellules mésenchymateuses, la glande surrénale est un organe endocrine composé de deux tissus différents avec différentes origines embryologiques, le cortex externe mésonéphriques dérivés mesoderm intermédiaire et les neurones medulla interne dérivée de crête. La corticosurrénale sécrète des stéroïdes (c.-à-d., les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes, hormones sexuelles), tandis que la médullosurrénale produit des catécholamines (c.-à-d., adrénaline, noradrénaline). En effectuant une recherche surrénalienne, il est important d’être capable de distinguer les cellules uniques avec des fonctions différentes. Ici, nous fournissons un protocole mis au point dans notre laboratoire qui décrit une série d’étapes séquentielles requises pour l’obtention d’immunofluorescence souillant pour caractériser les types de cellules de la glande surrénale. Nous nous concentrons d’abord sur la dissection des souris les glandes surrénales, l’élimination microscopique des graisses periadrenal suivie de la fixation, le traitement et la paraffine incorporant des tissus. Nous décrivons ensuite la découpe des blocs de tissus avec un microtome rotatif. Enfin, nous détaillons un protocole pour l’immunofluorescence des glandes surrénales que nous avons élaborée pour minimiser les anticorps non-spécifiques et autofluorescence afin d’obtenir un signal optimal.

La figure 1 représente une représentation schématique de l’ensemble du protocole décrit ci-dessus. Les glandes surrénales sont récoltées de souris, adjacent de tissus adipeux est enlevé sous un microscope à dissection et les surrénales sont ensuite fixés à 4 % PFA. Après cette étape, les glandes surrénales sont traitées et incorporés à la paraffine et sectionnés avec un microtome permettant de couper l’orgue en fines tranches qui sont d...

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Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Nous présentons ici une méthode pour isoler les glandes surrénales de souris, difficulté les tissus, leur section et effectuez l’immunofluorescence souillant.

Isolation, Fixation et l’Immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

L’immunofluorescence est une méthode de base qui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine surrénalien sur la zonation surrénale, l’identité cellulaire et la fonction. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de protéines multiples tout en préservant la morphologie du tissu surrénal. Pour enlever la glande surrénale murine, coupez autour du tissu adipeux environnant et placez la glande dans un puits d’une plaque de 24 multiwell contenant du PBS frais sur la glace.Transférez la glande sur une boîte de Pétri ou un support en verre sous un microscope disséquant et utilisez deux aiguilles de calibre 25 pour enlever le tissu adipeux adjacent. Lorsque toute la graisse a été enlevée, fixer le tissu dans 4%paraformaldéhyde à quatre degrés Celsius avec basculement pendant deux heures. À la fin de l’incubation, rincer la glande avec trois lavages de 15 minutes à quatre degrés Celsius en un à deux millilitres de PBS frais par lavage.Après le dernier lavage, déshydrater la glande en deux immersions séquentielles d’éthanol à quatre degrés Celsius avec basculement pendant deux heures par incubation. Pour préparer le tissu surrénalal pour le traitement, enveloppez la glande dans de la gaze et enfermez l’surrénale dans une cassette d’intégration tissulaire. Ensuite, placez la cassette dans un bocal rempli de 70 % d’éthanol pour un stockage de quatre degrés Celsius jusqu’au traitement.Pour traiter le tissu, insérez la cassette dans le processeur de tissu pour le traitement tel qu’indiqué dans le tableau. À la fin du programme, transférez la cassette dans une station d’intégration remplie de paraffine fondue à 65 degrés et utilisez une paire de forceps pour déballer la gaze. Transférer délicatement l’surrénale dans la position appropriée au centre de la base du moule d’intégration et verser la paraffine fondue sur la glande.Ensuite, déplacez soigneusement le moule d’intégration à un plateau de refroidissement pour faciliter le durcissement de la paraffine. Avant de sectionner par microtome rotatif, étiquetez une série de diapositives au microscope et étiez les glissières sur un chauffe-glissière de 37 degrés Celsius. Distribuez environ 450 microlitres d’eau ultra pure de type 1 autoclavé sur chaque glissière et réglez l’épaisseur de coupe de la section du microtome à cinq micromètres.Chargez le tissu incorporé sur le bloc de coupe et abaissez le bloc de paraffine jusqu’à ce que l’échantillon soit au niveau du visage avec le bord de la lame de microtome. Faire pivoter la roue à main avec un rythme régulier, effectuer une coupe initiale pour enlever la paraffine et exposer le tissu surrénalien. Ensuite, acquérir cinq sections de micromètres à travers l’extrémité de la glande surrénale à l’aide de forceps pour transférer chaque section dans la gouttelette d’eau sur l’une des diapositives pré-étiquetées comme il est recueilli.Après avoir confirmé la présence de tissu dans les sections par microscopie, séchez les glissières sur la plaque chaude pendant environ deux heures et faites-les cuire au moins toute la nuit sur un plateau de glissière à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’eau visible. Une fois sèches, conservez les glissières dans une boîte à glissière à température ambiante. Pour la récupération d’antigène d’immunofluorescence, dé-paraffinize les glissières avec deux immersions de cinq minutes de 100% xylène, suivies de la réhydratation dans une série descendante d’immersion d’éthanol et d’eau.Après l’immersion dans l’eau, transférer les glissières sur un porte-glissière métallique et placer le support dans un bécher de citrate molaire bouillant de 0,01 sur une plaque chaude pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, retirer le bécher de la plaque chaude et laisser refroidir pendant 20 minutes, en prenant soin que toutes les sections surrénales soient encore recouvertes de tampon. Lorsque le bécher est refroidi, transférer les glissières dans un bocal Coplin pendant trois lavages de 10 minutes dans du PBS frais avec un basculement doux.Après le dernier lavage, essuyez soigneusement la surface de chaque toboggan sans endommager les sections tissulaires et utilisez un marqueur hydrophobe pour faire un cercle autour de chaque section. Placez les glissières dans une chambre humidifiée et ajoutez rapidement au moins 50 microlitres de solution de blocage à chaque section pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation de blocage, lavez les glissières trois fois dans du PBS frais pendant cinq minutes par lavage avec le basculement et retournez les glissières à la chambre.Ensuite, ajoutez le cocktail principal d’anticorps d’intérêt à chaque section pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les échantillons avec trois lavages de 15 minutes en PBS frais par lavage et étiquetez les glissières avec la solution d’anticorps secondaire appropriée pendant une heure à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec trois lavages de 15 minutes sur un rocker protégé de la lumière, en étiquetant les noyaux des sections avec dapi pendant sept minutes à température ambiante protégée de la lumière après le dernier lavage.Après trois lavages PBS de cinq minutes avec bascule, ajouter 60 microlitres d’agent de montage adaptés à l’immunofluorescence le long de la surface d’un verre de couverture par échantillon et appuyez légèrement sur chaque côté de section de tissu de glissière vers le bas sur un verre de couverture, prenant soin d’éviter des bulles. Ensuite, déposer chaque glissière à plat dans un récipient sombre pour le séchage à température ambiante pendant au moins 24 heures avant l’imagerie. Pendant le processus d’élimination des graisses, il est essentiel de ne pas laisser sécher la glande surrénale car la déshydratation peut endommager la structure tissulaire.Après un déplacement réussi du tissu adipeux environnant, la glande surrénale devrait être facilement détectable sans graisse visible supplémentaire. L’immunostaining des sections surrénales de glande comme démontré indique le facteur steroidogenic nucléaire une coloration des cellules adrenocortical, la coloration d’hydroxylase de tyrosine des cellules médullaires, la coloration de DAPI des noyaux des cellules non stéroïdogènes de la capsule externe, et co-souillant avec les cellules adrenocortical et médullaires. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que les surrénales de souris sont petites et que leurs positions sont quelque peu variables rendant leur détection difficile.Par conséquent, il est crucial d’avoir une vue claire de la zone pendant la dissection. Ces procédures sont des techniques de base pour l’étude de la glande surrénale in vivo. Par la suite, d’autres méthodes d’immunostaining peuvent être effectuées pour répondre à des besoins scientifiques spécifiques.Après son développement, l’immunostaining a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines des sciences biomédicales pour explorer l’expression in situ des protéines, un outil utile dans de nombreuses disciplines et domaines.

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