Name: isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Wir danken Dr. Mohamad Zubair für seine Anregungen und technische Hilfe bei der Schaffung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen, nationale Institute der Gesundheit Research Grant 2R01-DK062027 (zu G.D.H) unterstützt.

Alle Methoden wurden gemäß institutionell zugelassenen Protokolle unter der Schirmherrschaft des Ausschusses über Nutzung und Pflege von Tieren an der University of Michigan Universität durchgeführt.
1. Vorbereitung für die Operation
<ol><li>Am Tag vor der Operation vorbereiten 4 % Paraformaldehyd (PFA) / Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Fahren Sie bei gefrorenen Aliquote mit einer Auftauen und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: 4 % ist PFA nicht für mehr als 48 h stabil. A...

<ol>
	<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry.">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+steroidogenesis.">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stevens &amp; Lowe's Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).</li><li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+for+human+catecholamine-synthesizing+enzymes.">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li><li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function.">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li><li>Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+methods+for+immunohistochemistry.">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li><li>Billinton, N., Knight, A. 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C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue.">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).</li><li>Watson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+autofluorescence+of+erythrocytes.">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Isolierung von Maus Nebennieren zusammen mit der Vorbereitung und Färbung der geschnittenen Paraffin-eingebetteten Maus Nebennieren.
Im Vergleich zu anderen Protokollen, die wir getestet, hat dieses Immunfluoreszenz-Protokoll für die meisten der in unserem Labor verwendeten Antikörper geeignet erwiesen. In bestimmten Fällen kann es jedoch, einige Anpassungen zur Verbesserung der Färbung Ergebnisse verlangen. Eine Variable, die leicht geän...

Immunohistochemistry ist eine Technik zur Erkennung von gewebeanteile mit dem Einsatz von Antikörpern gegen spezifische zelluläre Moleküle und anschließende befleckenden Techniken der konjugierten Antikörpern1zu erkennen. Diese immunhistochemische Verfahren erfordert spezielle Fixierung und Verarbeitung von Geweben, die für das Antigen oft empirisch ermittelt werden, Gewebe und Antikörper verwendet2. Die Fixierung ist entscheidend für den "ursprünglichen" Zustand des Gewebes und damit Erhaltung intakten zellulären und subzellulären Strukturen und Expressionsmuster beizubehalten. Weitere sind Verarbeitung und Einbettung Verfahren erforderlich, um das Gewebe vorbereiten, schneiden in dünne Scheiben schneiden, die histologische Studien mit Immunohistochemistry verwendet werden.
Immunostaining kann mit chromogenen oder fluoreszierende Erkennung durchgeführt werden. Chromogene Erkennung erfordert die Verwendung eines Enzyms zu einem löslichen Substrat in eine unlösliche farbige Produkt umzuwandeln. Während dieses Enzym an der Antikörper erkennt das Antigen (Primärantikörper) konjugiert werden kann, ist es immer öfter an den Antikörper erkennen den primären Antikörper (d.h. der Sekundärantikörper) konjugiert. Diese Technik ist sehr empfindlich; Das farbige Produkt aus der enzymatischen Reaktion ist Photostabil und erfordert nur ein Hellfeld-Mikroskop für die Bildgebung. Jedoch kann chromogenen Immunostaining nicht geeignet wenn Sie versuchen, zwei Proteine zu visualisieren, die Co lokalisieren, da die Abscheidung einer Farbe kann die Ablagerung des anderen Maske. Im Falle von Co Färbung, hat Immunfluoreszenz mehr als vorteilhaft erwiesen. Das Aufkommen der Immunfluoreszenz wird zugeschrieben Albert Coons und Kollegen, die ein System zur Identifizierung von Gewebe-Antigene mit Antikörpern mit Fluorescein gekennzeichnet und visualisieren im geschnittenen Gewebe unter ultraviolettem Licht3entwickelt. Fluoreszenz-Detektion basiert auf einem Antikörper konjugiert mit einem Fluorophore, die nach Anregung Licht ausstrahlt. Da gibt es mehrere Fluorophore mit Emissionen bei verschiedenen Wellenlängen (mit keine oder nur geringe Überlappung), eignet sich diese Nachweismethode für die Studien von mehreren Proteinen.
Die Nebenniere ist ein gekoppelten Organ befindet sich oberhalb der Niere und zeichnet sich durch zwei embryologically verschiedene Komponenten von mesenchymalen Kapsel umgeben. Die äußeren Nebennierenrinde, abgeleitet von der mesonephric mittlere Mesoderm sondert Steroidhormone während die inneren Medulla, abgeleitet aus der Neuralleiste Katecholamine wie Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin produziert. Die Nebennierenrinde histologisch und funktional gliedert sich in drei konzentrische Zonen mit jeder Zone sezernierenden verschiedene Klassen von Steroid-Hormone: die äußeren Zona Glomerulosa (zG) produziert Mineralocorticoids, die Elektrolyt-Homöostase zu regulieren und intravasale Volumen; die mittlere Zona Fasciculata (zF), sondert direkt unterhalb der zG, Glukokortikoide, die die Stress-Reaktion durch die Mobilisierung der Energiespeicher Erhöhung der Plasma-Glukose zu vermitteln; und der inneren Zona Reticularis (zR), die synthetisiert sex Steroid Vorläufer (d. h. Dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Einige Variationen in NNR Zonierung ist zwischen den Arten vorhanden: z. B. Mus Musculus fehlt der zR. Die einzigartige postnatale X-Zone des M. Musculus ist ein Überrest des fetalen Kortex zeichnet sich durch kleine Lipid-Armen Zellen mit acidophilen Cytoplasma5. Die X-Zone verschwindet in der Pubertät bei männlichen Mäusen und nach der ersten Schwangerschaft bei weiblichen Mäusen oder allmählich verkommt nicht gezüchtete Weibchen6,7. Darüber hinaus markiert die schlängelung und Dicke der zG Exponate Variation zwischen den Arten, wie Organisation von peripheren Stamm- und Vorläuferzellen in und neben der zG. Die Ratte, im Gegensatz zu anderen Nagetieren verfügt über eine sichtbare undifferenzierte Zone (zU) zwischen dem zG und zF funktioniert als eine Stammzell-Zone und/oder eine vorübergehende Verstärkung Stammväter-Zone. Ob die zU einzigartig für Ratten ist oder einfach mehr prominent Cluster von Zellen organisiert ist unbekannt8,9.
Zellen der Nebennierenrinde enthalten Lipid-Tröpfchen, die Cholesterin-Ester zu speichern, die als Vorläufer der alle Steroidhormone10,11dienen.  Der Begriff "steroidgenese" definiert den Prozess der Produktion von Steroidhormonen aus Cholesterin über eine Reihe von enzymatischen Reaktionen, bei denen die Aktivität von steroidogenic Factor 1 (SF1), deren Ausdruck ein Marker für steroidogenic Potenzial ist. In der Nebenniere ist Sf1 Ausdruck nur in den Zellen der Hirnrinde12vorhanden. Eine interessante Studie fand den Ausdruck der endogene Biotin in NNR Zellen mit steroidogenic potenzielle13. Während dies kann die Ursache für einen höheren Hintergrund in Biotin/Streptavidin-basierte Färbung Methoden, durch die Erkennung von endogenen Biotin durch Antikörper konjugiert mit Streptavidin, könnte dieses Merkmal auch eingesetzt werden, um den steroidogenic unterscheiden Zellen aus anderen Populationen innerhalb der Nebenniere, d. h., Endothelzellen, Kapsel und Medulla Zellen.
Sympathische neuroendokrine Neuronen innerviert, zeichnet sich das Nebennierenmark durch basophile Zellen mit einem körnigen Zytoplasma, Adrenalin und Noradrenalin enthalten. Medulla Zellen sind aufgrund des hohen Gehaltes an Katecholaminen, die braunes Pigment nach Oxidation14 bilden"chromaffin" benannt. Tyrosin-Hydroxylase (TH) ist das Enzym das katalysiert die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der Synthese der Katecholamine und in der Nebenniere, äußert sich nur in der Medulla15.
Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung der Maus Nebennieren, deren Verarbeitung für die Einbettung in Paraffin-Schnitt und eine Methode durchzuführen Immunfluoreszenz-Färbung auf Nebennieren Abschnitte um die zelluläre Arten bilden die Nebennierenrinde und Medulla. Dieses Protokoll ist ein Standard in unserem Labor für Immunostaining mit mehreren Antikörpern routinemäßig in unserer Forschung verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:156px;">Nest Biotechnology Co.</td>
			<td style="width:119px;">0412B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable needles 25Gx5/8&#34;</td>
			<td style="width:156px;">Exel International</td>
			<td style="width:119px;">26403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraplast plus&#160;</td>
			<td style="width:156px;">McCormik scientific</td>
			<td style="width:119px;">39502004</td>
			<td>Paraffin for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shandon biopsy cassettes II with attached lid</td>
			<td style="width:156px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">1001097</td>
			<td>Cassettes for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Edge</td>
			<td style="width:119px;">4685</td>
			<td>Disposable stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds</td>
			<td style="width:156px;">Polysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18986</td>
			<td>Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X5P1GAL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:156px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Certi-Pad Gauze pads&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Certified Safety Mfg, Inc</td>
			<td style="width:119px;">231-210</td>
			<td>3&#34;x3. Sterile latex free gauze pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M.O.M kit&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BMK-2202</td>
			<td>For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:156px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Wipes 4.4x8.4 inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super PAP PEN</td>
			<td style="width:156px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">00-8899</td>
			<td>Pen to draw on slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover glass&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td>Size: 22x50x1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542&#160;</td>
			<td>(Prepared in 20mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:156px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>Mounting agent for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-cite series 120Q</td>
			<td style="width:156px;">Lumen Dynamics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coolsnap Myo</td>
			<td style="width:156px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optiphot-2&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microtome</td>
			<td style="width:156px;">Americal Optical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue embedder</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">EG1150 H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue processor&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">ASP300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-TH</td>
			<td style="width:156px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB318</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-SF1</td>
			<td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td>
			<td style="width:119px;">&#160;custom made</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa-488 Mouse IgG&#160; raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003&#160;</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-505-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrate acid anhydrous</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A940-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NIS-Elements Basic Research&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands

Immunfluoreszenz ist eine etablierte Methode zur Erkennung von Antigenen in Geweben mit der Beschäftigung von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern und verfügt über ein breites Spektrum an Anwendungen. Erkennung von Antigenen ermöglicht die Charakterisierung und Identifizierung von mehreren Zelltypen. Oberhalb der Nieren und durch eine Schicht von mesenchymalen Zellen eingekapselt, ist der Nebenniere eine endokrine Organ, bestehend aus zwei verschiedenen Geweben mit unterschiedlicher embryologischen Herkunft, der mesonephric mittlere Mesoderm abgeleitet äußere Rinde und der neuronalen Kamm-abgeleiteten inneren Medulla. Die Nebennierenrinde sondert Steroide (d. h. Mineralocorticoids, Glukokortikoide, Sexualhormone), während das Nebennierenmark Katecholamine (z.B. Adrenalin, Noradrenalin) produziert. Während der Nebennieren forschen, ist es wichtig, einzigartige Zellen mit unterschiedlichen Funktionen unterscheiden zu können. Hier bieten wir ein Protokoll entwickelt, die in unserem Labor, das beschreibt eine Reihe von aufeinander folgenden Schritten erforderlich für den Erhalt der Immunfluoreszenz-Färbung, die Zelltypen der Nebenniere zu charakterisieren. Wir konzentrieren uns zunächst auf die Zerlegung der Nebennieren Maus die mikroskopische Entfernung von Periadrenal Fett, gefolgt von der Fixierung, die Verarbeitung und das Paraffin Einbettung des Gewebes. Wir beschreiben der Gewebe Blöcke mit einer rotierenden Mikrotom schneiden. Zu guter Letzt zeigen wir ein Protokoll für immunofluorescent Färbung der Nebennieren, die wir entwickelt haben, um unspezifische Antikörperbindung und Autofluoreszenz zu minimieren, um ein optimales Signal zu erreichen.

Abbildung 1 stellt eine schematische Darstellung des das gesamte Protokoll beschriebenen. Nebennieren werden geerntet, von Mäusen, angrenzende Fettgewebe wird entfernt, unter dem sezierenden Mikroskop und die Nebennieren sind dann fixiert, in 4 % PFA. Nach diesem Schritt sind Nebennieren verarbeitet und in Paraffin eingebettet und geschnitten mit ein Mikrotom, die Orgel in dünne Scheiben schneiden, die auf Objektträger abgelegt werden. Nach dem Trocknen de...

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Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Hier präsentieren wir eine Methode, um die Nebennieren von Mäusen zu isolieren, das Gewebe zu beheben, sie Abschnitt und durchführen Immunfluoreszenz-Färbung.

Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunfluoreszenz ist eine grundlegende Methode, die helfen kann, wichtige Fragen im Nebennierenfeld über Nebennierenzonation, Zellidentität und Funktion zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie das Studium mehrerer Proteine ermöglicht und gleichzeitig die Morphologie des Nebennierengewebes bewahrt. Um die murine Nebenniere zu entfernen, schneiden Sie das umgebende Fettgewebe um und legen Sie die Drüse in einen Brunnen einer 24-Multiwell-Platte mit frischen PBS auf Eis.Übertragen Sie die Drüse auf eine Petrischale oder Glasstütze unter einem Seziermikroskop und verwenden Sie zwei 25-Meter-Nadeln, um das angrenzende Fettgewebe zu entfernen. Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius mit Schaukeln für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Drüse mit drei 15-minütigen Wäschen bei vier Grad Celsius in ein bis zwei Millilitern frischer PBS pro Wäsche.Nach der letzten Wäsche die Drüse in zwei sequenziellen Ethanol-Eintauchen bei vier Grad Celsius mit Schaukeln für zwei Stunden pro Inkubation dehydrieren. Um das Nebennierengewebe für die Verarbeitung vorzubereiten, wickeln Sie die Drüse in Gaze und umschließen Sie die Nebenniere in einer Gewebeeinbettungskassette. Dann legen Sie die Kassette in ein Glas gefüllt mit 70% Ethanol für vier Grad Celsius Lagerung bis zur Verarbeitung.Um das Gewebe zu verarbeiten, legen Sie die Kassette zur Verarbeitung in den Gewebeprozessor ein, wie in der Tabelle angegeben. Übertragen Sie die Kassette am Ende des Programms in eine einbettende Station, die mit geschmolzenem 65-Grad-Paraffin gefüllt ist, und verwenden Sie ein Paar Zangen, um die Gaze auszupacken. Übertragen Sie die Nebenniere in der entsprechenden Position in der Mitte der Basis der Einbettform vorsichtig und gießen Sie das geschmolzene Paraffin auf die Drüse.Dann bewegen Sie die Einbettform vorsichtig in eine Kühlschale, um das Aushärten des Paraffins zu erleichtern. Vor dem Schnitt durch Rotationsmikrotome eine Reihe von Mikroskop-Dias beschriften und die Dias auf einen 37-Grad-Celsius-Diawärmer legen. Geben Sie ca. 450 Mikroliter autoklaviertes Typ ein ultrareines Wasser auf jeden Schlitten und stellen Sie die Schnittdicke des Mikrotomes auf fünf Mikrometer ein.Laden Sie das eingebettete Gewebe auf den Schneidblock und senken Sie den Paraffinblock, bis sich die Probe mit der Kante der Mikrotomklinge auf Flächenhöhe befindet. Drehen Sie das Handrad mit einem gleichmäßigen Rhythmus, führen Sie eine erste Trimmung, um das Paraffin zu entfernen und das Nebennierengewebe freizulegen. Erwerben Sie dann fünf Mikrometerabschnitte durch das Ende der Nebenniere mit Zangen, um jeden Abschnitt in den Wassertropfen auf eine der vorbeschrifteten Dias zu übertragen, während sie gesammelt wird.Nachdem Sie das Vorhandensein von Gewebe in den Abschnitten durch Mikroskopie bestätigt haben, trocknen Sie die Dias auf der Kochplatte für etwa zwei Stunden und backen Sie sie mindestens über Nacht auf einer Rutschschale bei 37 Grad Celsius, bis kein Wasser mehr sichtbar ist. Nach dem Trocknen die Dias in einer Diabox bei Raumtemperatur aufbewahren. Für Immunfluoreszenz-Antigen-Retrieval, de-paraffinieren Sie die Dias mit zwei fünfminütigen 100%xylol-Tauchionen, gefolgt von Rehydrierung in einer absteigenden Ethanol- und Wasser-Immersion-Serie.Nach dem Eintauchen ins Wasser die Dias auf einen Metallschieberhalter übertragen und den Halter 10 Minuten lang in ein Becherbecher aus kochendem 0,01 Molar-Citrat auf eine Kochplatte legen. Am Ende der Inkubation, entfernen Sie das Becherglas von der Kochplatte und lassen Sie es für 20 Minuten abkühlen, wobei darauf zu achten, dass alle Nebennierenabschnitte noch mit Puffer bedeckt sind. Wenn der Becher gekühlt ist, übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas für drei 10-minütige Wärerungen in frischem PBS mit sanftem Schaukeln.Wischen Sie nach dem letzten Waschen die Oberfläche jedes Dias sorgfältig ab, ohne die Gewebeabschnitte zu beschädigen, und verwenden Sie einen hydrophoben Marker, um einen Kreis um jeden Abschnitt zu bilden. Legen Sie die Dias in eine befeuchtete Kammer und fügen Sie schnell mindestens 50 Mikroliter Blockierlösung zu jedem Abschnitt für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Am Ende der blockierenden Inkubation die Dias dreimal in frischem PBS für fünf Minuten pro Wäsche mit Schaukeln waschen und diagleitet in die Kammer zurück.Als nächstes fügen Sie den primären Antikörpercocktail von Interesse zu jedem Abschnitt für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu. Am nächsten Morgen die Proben mit drei 15-minütigen Wärten in frischem PBS pro Waschgang waschen und die Dias mit der entsprechenden Sekundärantikörperlösung für eine Stunde lichtgeschützt beschriften. Am Ende der Inkubation die Proben mit drei 15-minütigen Wäschen auf einer lichtgeschützten Wippe waschen und die Kerne der Abschnitte sieben Minuten lang bei Lichtschutz nach der letzten Wäsche mit DAPI beschriften.Nach drei fünfminütigen PBS-Waschungen mit Schaukeln 60 Mikroliter Montagemittel hinzufügen, die für die Immunfluoreszenz geeignet sind, entlang der Oberfläche eines Deckglases pro Probe, und jede Schiebegewebeseite leicht auf ein Deckglas drücken, wobei darauf zu achten ist, Blasen zu vermeiden. Legen Sie dann jede Rutsche flach in einen dunklen Behälter, um sie bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden lang zu härten, bevor sie gebildert werden. Während des Fettentfernungsprozesses ist es wichtig, die Nebenniere nicht austrocknen zu lassen, da Dehydrierung die Gewebestruktur schädigen kann.Nach erfolgreicher Entfernung des umgebenden Fettgewebes sollte die Nebenniere ohne zusätzliches sichtbares Fett leicht nachweisbar sein. Immunostaining of adrenal drüsen abschnitte wie gezeigt zeigt kernnuklearen steroidogenen Faktor eine Färbung der adrenocortical Zellen, Tyrosin Hydroxylase Färbung der medullären Zellen, DAPI Färbung der Kerne der nicht-steroidogenen Zellen der äußeren Kapsel, und Co-Färbung mit adrenocortical und medullary Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Maus-Adrenale klein sind und dass ihre Positionen etwas variabel sind, was ihre Erkennung erschwert.Daher ist es entscheidend, während der Zerlegung einen klaren Blick auf das Gebiet zu haben. Diese Verfahren sind grundlegende Techniken für die Untersuchung der Nebenniere in vivo. Im Anschluss daran können zusätzliche Methoden der Immunfärbung durchgeführt werden, um spezifische wissenschaftliche Bedürfnisse zu erfüllen.Nach seiner Entwicklung ebnete die Immunfärbung den Weg für Forscher in den biomedizinischen Wissenschaftsbereichen, um die In-situ-Proteinexpression zu erforschen, ein nützliches Werkzeug in vielen Disziplinen und Bereichen.

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