Name: isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Mohamad Zubair per i suoi utili suggerimenti e assistenza tecnica alla creazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Diabetes e digerente e malattie renali, istituti nazionali di salute Research Grant 2R01-DK062027 (per Gallucci).

Tutti i metodi sono stati effettuati secondo protocolli istituzionalmente approvati sotto gli auspici del Comitato Università sull'uso e la cura degli animali presso l'Università del Michigan.
1. preparazione per la chirurgia
<ol><li>Il giorno prima dell'intervento chirurgico, preparare la paraformaldeide al 4% (PFA) / tampone fosfato salino (PBS). In caso di aliquote congelate, procedere a scongelare uno e conservare a 4 ° C. Nota: 4% PFA non è stabile per più di 48 h. Attenzione...

<ol>
	<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry.">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Stem/+Progenitor+Cell+Maintenance+in+the+Adrenal+Cortex.">Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Yates, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+Development,+Maintenance,+and+Disease.">Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease.</a> Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).</li><li>Jones, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+Mouse+Adrenal+Cortex+with+Special+Reference+to+the+Zona+Reticularis+and+to+Brown+Degeneration,+Together+with+a+Discussion+of+the+Cell+Migration+Theory.">Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).</li><li>Sucheston, M. E. C., Samuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transient-Zone+in+the+Human+and+Mouse+Adrenal+Gland.">The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland.</a> The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).</li><li>Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Sonic+hedgehog+secreting+and+receiving+cells+in+the+developing+and+adult+rat+adrenal+cortex.">Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).</li><li>Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+zonation,+renewal,+and+remodeling.">Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Finally+Get+a+Little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li><li>Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+steroidogenic+cells.">Lipid droplets and steroidogenic cells.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).</li><li>Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+steroidogenesis.">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stevens &amp; Lowe's Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).</li><li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+for+human+catecholamine-synthesizing+enzymes.">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li><li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function.">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li><li>Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+methods+for+immunohistochemistry.">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorometric+determination+of+the+stable+state+of+aggregation+in+hemoglobins.">Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins.</a> Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue.">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).</li><li>Watson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+autofluorescence+of+erythrocytes.">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li></ol>

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento delle ghiandole surrenali del mouse insieme con la preparazione e colorazione delle ghiandole surrenali sezionato paraffina-incastonato del mouse.
Rispetto ad altri protocolli che abbiamo testato, questo protocollo di immunofluorescenza ha dimostrato adatto per la maggior parte degli anticorpi utilizzati nel nostro laboratorio. Tuttavia, in alcuni casi può richiedere qualche aggiustamento per migliorare i risultati di colorazione. Una vari...

Immunohistochemistry è una tecnica per la rilevazione di componenti del tessuto con l'uso di anticorpi contro specifiche molecole cellulari e successive tecniche di colorazione per rilevare gli anticorpi coniugati1. Questa procedura di immunohistochemical richiede particolare attenzione e il trattamento dei tessuti che sono spesso empiricamente determinati per l'antigene specifico, dei tessuti e l'anticorpo utilizzato2. La fissazione è cruciale per mantenere lo stato "originale" del tessuto e quindi mantenendo intatto cellular e strutture subcellulari e modelli di espressione. Ulteriore elaborazione e incorporare procedure necessari per preparare il tessuto per il taglio a fettine sottili che vengono utilizzati per gli studi istologici che coinvolgono immunohistochemistry.
Immunostaining può essere eseguita con rilevamento o cromogenico o fluorescente. Cromogenico rilevamento richiede l'utilizzo di un enzima per convertire un substrato solubile in un prodotto colorato insolubile. Mentre questo enzima può essere coniugato all'anticorpo riconosce l'antigene (anticorpo primario), esso è più spesso coniugata con l'anticorpo che riconosce l'anticorpo primario (cioè, l'anticorpo secondario). Questa tecnica è altamente sensibile; il prodotto colorato risultante dalla reazione enzimatica è fotostabile e richiede solo un microscopio a campo chiaro per l'imaging. Tuttavia, cromogenico immunostaining può non essere adatto quando si tenta di visualizzare due proteine che co-localizzano, poiché la deposizione di un colore può mascherare la deposizione di altro. In caso di co-macchiatura, immunofluorescenza ha dimostrato di essere più vantaggioso. L'avvento dell'immunofluorescenza è attribuita a Albert Coons e colleghi, che ha sviluppato un sistema per identificare gli antigeni del tessuto con anticorpi marcati con fluoresceina e visualizzarli nei tessuti sezionati sotto luce ultravioletta3. Rilevazione della fluorescenza è basato su un anticorpo coniugato con un fluoroforo che emette luce dopo l'eccitazione. Poiché esistono diversi fluorofori con emissioni a lunghezze d'onda (con poca o nessuna sovrapposizione), questo metodo di rilevamento è ideale per gli studi di molte proteine.
Il surrene è un organo accoppiato situato sopra il rene e caratterizzato da due componenti embriologicamente distinte, circondate da una capsula mesenchymal. Corteccia surrenale esterna, derivata dal mesoderma intermedio mesonefrici, secerne ormoni steroidei, mentre il midollo interno, derivato dalla cresta neurale, produce le catecolamine tra cui adrenalina, noradrenalina e dopamina. La corteccia surrenale è istologicamente e funzionalmente suddiviso in tre zone concentriche, con ogni zona che secernono diverse classi di ormoni steroidei: l'esterno zona glomerulare (zG) produce mineralcorticoidi che regolano l'omeostasi dell'elettrolito e volume intravascolare; la centrale zona fascicolata (zF), direttamente sotto il zG, secerne i glucocorticoidi che mediano la risposta allo stress attraverso la mobilitazione delle riserve di energia per aumentare il glucosio del plasma; e i reticularis di zona interna (zR), che sintetizza il sesso precursori steroidei (cioè, del deidroepiandrosterone (DHEAS))4.
Qualche variazione nella zonazione corticosurrenale è presente tra le specie: per esempio, Mus musculus manca la zR. X-zone postnatale unica di M. musculus è un residuo della corteccia fetale caratterizzata da piccole cellule lipido-poveri con acidofilico citoplasmi5. X-zone scomparirà alla pubertà nei topi maschi e dopo la prima gravidanza nei topi femmina, o gradualmente degenera in femmine di razza non6,7. Inoltre, la tortuosità e lo spessore delle esposizioni zG segnato variazione tra le specie come organizzazione delle cellule staminali e progenitori periferiche in ed adiacente la zG. Il ratto, a differenza di altri roditori, ha una zona indifferenziata visibile (zU) tra il zG e zF che funzioni come una zona di cellule staminali e/o una zona del transiente amplificando progenitori. Se il zU è unica ai ratti o semplicemente un più prominente organizzato aggregato di cellule è sconosciuto8,9.
Le cellule della corteccia surrenale contengono goccioline lipidiche contenenti esteri del colesterolo che servono come il precursore di tutti gli ormoni steroidei10,11.  Il termine "steroidogenesi" definisce il processo di produzione di ormoni steroidei dal colesterolo tramite una serie di reazioni enzimatiche che coinvolgono l'attività del fattore steroidogenico 1 (SF1), la cui espressione è un indicatore del potenziale steroidogenic. Nella ghiandola adrenale, Sf1 espressione è presente solo nelle cellule della corteccia12. Un interessante studio ha trovato l'espressione di biotina endogena in cellule corticosurrenali con potenziali steroidogenic13. Mentre questo può essere la causa di un più elevato background in metodi di colorazione biotina/streptavidina-base, a causa del rilevamento di biotina endogena di anticorpo coniugato con streptavidina, questa caratteristica potrebbe essere impiegata anche per distinguere il steroidogenic cellule da altre popolazioni all'interno della ghiandola surrenale, cioè, endoteliale, capsulare e cellule di midollo.
Innervati dai neuroni preganglionic simpatici, il midollo surrenale è caratterizzato da cellule basophilic con un citoplasma granulare contenente epinefrina e norepinefrina. Cellule di midollo sono denominate "cromaffine" grazie all'elevato contenuto di catecolamine che formano un pigmento marrone dopo ossidazione14. Tirosina idrossilasi (TH) è l'enzima che catalizza la tappa limitante della sintesi delle catecolamine e, nella ghiandola adrenale, è espresso solo nel midollo15.
Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento delle ghiandole surrenali di mouse, loro elaborazione per l'incorporamento in paraffina e sezionamento e un metodo per eseguire immunofluorescenza su sezioni adrenale di colorazione al fine di identificare i tipi cellulari che costituiscono il corteccia surrenale e nel midollo. Questo protocollo è uno standard nel nostro laboratorio per immunostaining con gli anticorpi più abitualmente utilizzati nella nostra ricerca.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:156px;">Nest Biotechnology Co.</td>
			<td style="width:119px;">0412B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable needles 25Gx5/8&#34;</td>
			<td style="width:156px;">Exel International</td>
			<td style="width:119px;">26403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraplast plus&#160;</td>
			<td style="width:156px;">McCormik scientific</td>
			<td style="width:119px;">39502004</td>
			<td>Paraffin for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shandon biopsy cassettes II with attached lid</td>
			<td style="width:156px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">1001097</td>
			<td>Cassettes for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Edge</td>
			<td style="width:119px;">4685</td>
			<td>Disposable stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds</td>
			<td style="width:156px;">Polysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18986</td>
			<td>Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X5P1GAL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:156px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Certi-Pad Gauze pads&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Certified Safety Mfg, Inc</td>
			<td style="width:119px;">231-210</td>
			<td>3&#34;x3. Sterile latex free gauze pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M.O.M kit&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BMK-2202</td>
			<td>For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:156px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Wipes 4.4x8.4 inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super PAP PEN</td>
			<td style="width:156px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">00-8899</td>
			<td>Pen to draw on slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover glass&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td>Size: 22x50x1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542&#160;</td>
			<td>(Prepared in 20mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:156px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>Mounting agent for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-cite series 120Q</td>
			<td style="width:156px;">Lumen Dynamics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coolsnap Myo</td>
			<td style="width:156px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optiphot-2&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microtome</td>
			<td style="width:156px;">Americal Optical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue embedder</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">EG1150 H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue processor&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">ASP300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-TH</td>
			<td style="width:156px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB318</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-SF1</td>
			<td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td>
			<td style="width:119px;">&#160;custom made</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa-488 Mouse IgG&#160; raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003&#160;</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-505-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrate acid anhydrous</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A940-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NIS-Elements Basic Research&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands

L'immunofluorescenza è una tecnica affermata per il rilevamento degli antigeni nei tessuti con l'impiego di anticorpi coniugati fluorocromo e ha un ampio spettro di applicazioni. Rilevamento degli antigeni permette per la caratterizzazione ed identificazione di più tipi di cellule. Situato sopra i reni e incapsulati da uno strato di cellule mesenchimali, il surrene è un organo endocrino, composto da due tessuti differenti con differenti origini embriologiche, mesonephric intermedia derivati mesoderma corteccia esterna e neurali derivati dalla cresta midollo interno. La corteccia surrenale secerne steroidi (cioè, i mineralcorticoidi, glucocorticoidi, ormoni sessuali), mentre il midollo surrenale produce catecolamine (cioè, adrenalina, noradrenalina). Durante lo svolgimento di ricerca adrenale, è importante essere in grado di distinguere le uniche cellule con funzioni diverse. Qui forniamo un protocollo sviluppato nel nostro laboratorio che descrive una serie di passi sequenziali necessarie per ottenere la colorazione di immunofluorescenza per caratterizzare i tipi di cellule della ghiandola surrenale. Prima ci concentriamo sulla dissezione delle ghiandole surrenali del mouse, la rimozione microscopica del grasso di periadrenal seguita dalla fissazione, elaborazione e inclusione in paraffina del tessuto. Descriviamo quindi la divisione dei blocchi di tessuto con un microtomo rotativo. Infine, abbiamo dettaglio un protocollo per la macchiatura immunofluorescente delle ghiandole adrenali che abbiamo sviluppato per ridurre al minimo sia non specifico anticorpo che lega e autofluorescenza al fine di ottenere un segnale ottimo.

Figura 1 rappresenta lo schema dell'intero protocollo descritto in precedenza. Ghiandole surrenali vengono raccolte dai topi, tessuto adiposo adiacente viene rimosso sotto un microscopio per dissezione e adrenale sono fissate in 4% PFA. Dopo questo passaggio, le ghiandole surrenali sono elaborate e inclusi in paraffina e sezionate con un microtomo per tagliare l'organo in fette sottili che si depositano su vetrini da microscopio. Dopo l'essiccazione delle sez...

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Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Qui presentiamo un metodo per isolare ghiandole surrenali da topi, difficoltà i tessuti, sezione loro ed eseguire la colorazione di immunofluorescenza.

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

L'immunofluorescenza è un metodo di base che può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo surrenale sulla zonazione surrenale, l'identità cellulare e la funzione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio di più proteine preservando la morfologia del tessuto surrenale. Per rimuovere la ghiandola surrenale murina, tagliare intorno al tessuto adiposo circostante e posizionare la ghiandola in un pozzo di una piastra a 24 polilitri contenente PBS fresco sul ghiaccio.Trasferire la ghiandola su una piastra di Petri o un supporto di vetro al microscopio sezionato e utilizzare due aghi calibro 25 per rimuovere il tessuto adiposo adiacente. Quando tutto il grasso è stato rimosso, fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius con dondolo per due ore. Alla fine dell'incubazione, sciacquare la ghiandola con tre lavaggi di 15 minuti a quattro gradi Celsius in uno o due millilitri di PBS fresco per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare la ghiandola in due immersioni sequenziali di etanolo a quattro gradi Celsius con dondolo per due ore per incubazione. Per preparare il tessuto surrenale per la lavorazione, avvolgere la ghiandola in garza e racchiudere la surrenalica in una cassetta che incorpora tessuti. Quindi, posizionare la cassetta in un barattolo riempito con 70%etanolo per uno stoccaggio di quattro gradi Celsius fino alla lavorazione.Per elaborare il tessuto, inserire la cassetta nel processore tissutale per la lavorazione come indicato nella tabella. Alla fine del programma, trasferire la cassetta in una stazione di incorporamento piena di paraffina 65 gradi fusa e utilizzare un paio di forcep per scartare la garza. Trasferire delicatamente la surrenalica nella posizione appropriata al centro della base dello stampo di incorporamento e versare la paraffina fusa sulla ghiandola.Quindi, spostare attentamente lo stampo di incorporamento su un vassoio di raffreddamento per facilitare l'indurimento della paraffina. Prima di sessare con microtomo rotante, etichettare una serie di vetrini al microscopio e posare le diapositive su uno scaldascivolo Celsius di 37 gradi. Distribuire circa 450 microlitri di acqua ultra pura di tipo autoclavato su ogni scivolo e impostare lo spessore di taglio della sezione del microtomo su cinque micrometri.Caricare il tessuto incorporato sul blocco di taglio e abbassare il blocco di paraffina fino a quando il campione non è a livello del viso con il bordo della lama del microtomo. Ruotando il volantino con un ritmo costante, eseguire un taglio iniziale per rimuovere la paraffina ed esporre il tessuto surrenale. Quindi, acquisire cinque sezioni di micrometro attraverso l'estremità della ghiandola surrenale usando le forcep per trasferire ogni sezione nella goccia d'acqua su uno dei vetri pre-etichettati man mano che viene raccolta.Dopo aver confermato la presenza di tessuto nelle sezioni per microscopia, asciugare gli scivoli sulla piastra calda per circa due ore e cuocerli almeno durante la notte su una slide tray a 37 gradi Celsius fino a quando non è visibile più acqua. Una volta asciutti, conservare le diapositive in una slide box a temperatura ambiente. Per il recupero dell'antigene ad immunofluorescenza, de-paraffinare le diapositive con due immersioni di cinque minuti al 100% di xilene, seguite da reidratazione in una serie di immersione in etanolo e acqua discendente.Dopo l'immersione in acqua, trasferire gli scivoli su un supporto per vetrini metallici e posizionare il supporto in un bicchiere di citrato molare bollente 0,01 su una piastra calda per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, rimuovere il becher dalla piastra calda e lasciarlo raffreddare per 20 minuti, facendo attenzione che tutte le sezioni surrenali siano ancora coperte di tampone. Quando il becher viene raffreddato, trasferire gli scivoli in un barattolo coplin per tre lavaggi di 10 minuti in PBS fresco con un leggero dondolo.Dopo l'ultimo lavaggio, pulire con cura la superficie di ogni diapositiva senza danneggiare le sezioni tissutali e utilizzare un marcatore idrofobico per creare un cerchio intorno a ogni sezione. Posizionare i vetrini in una camera umidificata e aggiungere rapidamente almeno 50 microlitri di soluzione di blocco ad ogni sezione per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di blocco, lavare gli scivoli tre volte in PBS fresco per cinque minuti per lavaggio con dondolo e restituire gli scivoli alla camera.Successivamente, aggiungere il cocktail di anticorpi primari di interesse a ogni sezione per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, lavare i campioni con tre lavaggi di 15 minuti in PBS fresco per lavaggio ed etichettare i vetrini con l'appropriata soluzione anticorpale secondaria per un'ora protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con tre lavaggi di 15 minuti su un rocker protetto dalla luce, etichettando i nuclei delle sezioni con DAPI per sette minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce dopo l'ultimo lavaggio.Dopo tre lavaggi PBS di cinque minuti con dondolo, aggiungere 60 microlitri di agente di montaggio adatti all'immunofluorescenza lungo la superficie di un vetro di copertura per campione e premere leggermente ogni sezione del tessuto di scorrimento sul vetro di copertura, facendo attenzione ad evitare bolle. Quindi, posare ogni scivolo piatto in un contenitore scuro per la polimerizzazione a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima dell'imaging. Durante il processo di rimozione del grasso, è fondamentale non lasciare asciugare la ghiandola surrenale poiché la disidratazione può danneggiare la struttura del tessuto.A seguito di una rimozione riuscita del tessuto adiposo circostante, la ghiandola surrenale dovrebbe essere facilmente rilevabile senza grasso visibile aggiuntivo. L'immunosottenzione delle sezioni di ghiandola surrenale come dimostrato rivela il fattore steroidogenico nucleare una colorazione delle cellule adrenocorticali, la colorazione dell'idrossilasi tirosina delle cellule midollari, la colorazione DAPI dei nuclei delle cellule non steroidogeniche della capsula esterna e la co-colorazione con cellule adrenocorticali e midollari. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che le surrenali del mouse sono piccole e che le loro posizioni sono in qualche modo variabili rendendo difficile il loro rilevamento.Pertanto, è fondamentale avere una visione chiara dell'area durante la dissezione. Queste procedure sono tecniche di base per lo studio della ghiandola surrenale in vivo. A seguito di questi, è possibile eseguire ulteriori metodi di immunosocienza per soddisfare specifiche esigenze scientifiche.Dopo il suo sviluppo, l'immunostaining ha spianato la strada ai ricercatori nei campi della scienza biomedica per esplorare l'espressione proteica in situ, uno strumento utile in molte discipline e campi.

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